朱海荣，张 娟，刘 爽，于燕萍，于晓菲，孟 强

（山东省产品质量检验研究院，济南 250100）

植物生长调节剂（Plant growth regulates，PGRs）是一类可调控植物生长发育的外源性非营养性化学合成物［1］。近年来应用植物生长调节剂已成为现代农业改善作物品质、提高作物产量及作物抗逆抗病能力的重要措施［2-6］。随着应用情况不断增多，在保障作物增产高效的同时，植物生长调节剂也对农业生产安全、生态环境和人体健康造成了一定程度的隐患。因肥料中隐性添加植物生长调节剂，导致作物减产甚至绝产的现象时有发生，同时带来了土壤及水源污染问题［7，8］。因此，建立一套科学、合理的检测技术体系，加强肥料中非法添加植物生长调节剂的监控工作，具有重要意义。

如何建立快速高效的植物生长调节剂检测技术一直以来都是农业科学领域研究热点之一，利用色谱法或色谱-质谱联用法等测定蔬菜、水果及粮谷等作物中植物生长调节剂的残留报道较多［9-16］，近年来植物生长调节剂在肥料产品中的定量技术也逐渐出现，但利用液相色谱仪或气相色谱仪，一种检测方法同时检测 1～4 种目标物的报道居多［17-23］，且检测方法灵敏度普遍不高。本研究针对肥料中可能添加的8 种植物生长调节剂，优化了色谱条件，考察了色谱提取溶剂、分离柱、流动相等影响因素，选择添加0.1%甲酸的甲醇作为提取溶剂，样品经过超声提取并净化，利用液相色谱仪测定后采用标准曲线外标法定量。经方法学验证后证明，该技术稳定、快捷、高效，满足肥料产品质量监测需求，可为肥料产品施用及行业技术规范制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 型 Infinity 液相色谱仪（配 PDA），美国安捷伦公司；KQ-700DB 型超声波清洗器，中国江苏昆山超声仪器有限公司；H-1650 型台式高速离心机，上海凌仪生物科技有限公司；VORTEX-KB3型漩涡混合器，海门其林贝尔仪器制造有限公司；BSA224S 型电子分析天平，德国Sartorius 公司。

植物生长调节剂标准品（质量分数＞97.0%），德国Dr.Ehrenstorfer 公司；甲酸（色谱纯），美国霍尼韦尔公司；甲醇（色谱纯），中国赛默飞世尔科技有限公司；市售娃哈哈纯净水。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

1）标准储备溶液配制。分别精确称取6-苄氨基嘌呤、吲哚乙酸、脱落酸、吲哚丁酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）标准品20.0 mg（精度0.1 mg），用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成2 000 mg/L 的标准储备溶液，贮存于-18 ℃条件下，有效期3 个月。

2）系列混合标准溶液配制。以甲醇为溶剂，采用逐级稀释的方式，配制质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L 的植物生长调节剂系列混合标准溶液，现配现用。

1.2.2 样品前处理

1）样品制备。固体样品：粉碎后，过0.5 mm 试验筛待用；液体样品：混匀后称取。

2）提取、净化。称取 0.5～1.0 g（精度0.1 mg）肥料样品，准确加入10 mL 含0.1%甲酸的甲醇溶液于具塞离心管中，涡旋振荡1 min，室温超声提取20 min，以6 000 r/min 高速离心5 min，取上清液1 mL，过0.22 μm 有机相微孔滤膜，供液相色谱仪测定。提取溶剂超声时若产生溶剂挥发损失，应进行补液。

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30 ℃；进样体积10 μL；流速：0.8 mL/min；流动相A 为甲酸水溶液（甲酸体积分数为0.1%），B 为甲醇。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 提取溶剂

甲醇和乙腈对多种植物生长调节剂均有较好的溶解性，适用于极性范围较宽的植物生长调节剂同时提取。吴爱娟等［18］选择提取剂磷酸水溶液和乙腈，测定了水溶性肥料中的赤霉素、噻苯隆、氯吡脲和多效唑，张泸文等［12］提取果蔬中26 种植物生长调节剂时发现，乙腈的提取物干扰少于甲醇。选择氨基酸水溶性肥料进行加标回收试验，依据目标化合物的溶解性能，结合已报道文献［10-13］，试验考察了甲醇、0.1%甲酸-甲醇、乙腈、0.1%甲酸-乙腈对目标物的提取效果（图1）。结果显示，6-苄氨基嘌呤在甲醇体系中的提取效果优于乙腈；在甲醇中加入0.1%甲酸后，脱落酸、萘乙酸、2，4-D 的回收率明显上升；0.1%甲酸-甲醇体系综合提取效果最佳，各目标化合物加标回收率均在78%以上。甲酸的加入提高了脱落酸、萘乙酸、2，4-D 的提取效果，原因是酸性环境抑制了目标物的电离，增强了其在甲醇中的溶解性能。因此，确定添加0.1%甲酸的甲醇作为提取溶剂。

图1 提取溶剂对目标物回收率的影响

2.2 色谱柱

色谱柱的筛选是方法开发的关键环节，根据化合物的极性大小、分子大小及pKa值，查阅色谱柱选择对照表后，试验选择Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和 Waters Symmetry Shield RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱分离柱，并进行了梯度洗脱条件优化（图2），发现2 种色谱柱均可实现8种植物生长调节剂的有效分离，但以Waters Symmetry Shield RP18色谱柱为分析柱时，吲哚乙酸与6-苄氨基嘌呤、氯吡脲与2，4-D 2 组目标物保留时间相差较短，样品中出现高浓度目标物时，易产生分析干扰。因此，选择ZORBAX SB-C18柱作为分析柱。

图2 50.0 mg/L 混合标准溶液的色谱

2.3 流动相

液相色谱法分离多种目标物，选择流动相时，需要兼顾各目标化合物的响应强度、峰形及分离性能。试验最初采用乙腈和水组成的二元梯度洗脱体系，难以实现8 种目标物的有效分离，且目标物总体出峰时间过长；优化二元梯度洗脱体系，强洗脱溶剂选择甲醇或乙腈，弱洗脱溶剂选择水、0.1%甲酸水或5 mmol/L 乙酸铵，并对其不同搭配进行了比较。结果表明，甲醇作为强洗脱溶剂时，各目标化合物响应良好，且分离性能优于乙腈；另外，甲酸的加入可促进目标化合物的分离，并能显著改善2，4-D、萘乙酸、脱落酸等酸性化合物的峰形。因此，选择甲醇和0.1%的甲酸溶液作为流动相。在优化的仪器工作条件下，各目标物的分离度R大于1.5，27 min 内即可实现8 种植物生长调节剂的分析，显著提高了检测效率。

2.4 检测波长

以三维（3D）检测模式，对目标物的单标溶液在波长200～500 nm 下进行紫外光谱扫描，确定氯吡脲、烯效唑、脱落酸3 种目标物最佳检测波长为258 nm，6-苄氨基嘌呤最佳检测波长为270 nm，萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2，4-D 的最佳检测波长为280 nm。兼顾检测灵敏度和检测效率，试验选择波长280 nm 对8 种植物生长调节剂进行测定，此波长下基线平稳且各目标物响应良好。

2.5 方法学验证

2.5.1 标准曲线和检出限 在选定的最佳仪器条件下对8 种植物生长调节剂系列混合标准溶液进行测定，以峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线。从表2 可以看出，在1.0～100.0 mg/L 范围内8 种植物生长调节剂的质量浓度与峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999 8。将标准系列溶液最低点经过多级稀释，利用已知浓度的标准溶液与空白样品的测量信号进行比较，确定信噪比，以3倍的信噪比确定方法检出限为0.5～10.0 mg/kg。

表2 线性回归方程、相关系数、检出限测试结果

2.5.2 精密度和准确度试验 准确称取5 份同一批次肥料样品，其中4 份分别添加4 个浓度水平的目标物混合标准溶液（涵盖高、中、低浓度），每个水平按照“1.2.3”的色谱条件进行6 次重复测定，验证样品的加标回收率和相对标准偏差，具体数据见表3。结果表明，肥料样品中8 种植物生长调节剂的平均回收率为78.2%～109.4%，相对标准偏差（RSD）在6.0%以下，证明该方法的准确度和精密度良好，满足同时检测肥料中8 种植物生长调节剂的测量要求。空白肥料样品的加标色谱见图3。

表3 加标回收率和相对标准偏差（RSD）测试结果（n=6）

2.6 检测方法的实际应用

按试验方法对不同基质的30 批次市售肥料样品进行分析。检测结果（图3）显示，肥料样品中基质未对分析目标物产生干扰，共5 批次样品检出植物生长调节剂，检出率为16.7%；其中3 批次肥料检出萘乙酸，含量为0.5%～0.9%，2 批次肥料检出烯效唑，含量分别为1.1%和3.6%，证明肥料产品中存在隐性添加植物生长调节剂的现象，应引起重视。

图3 空白肥料样品的加标色谱

3 小结

本研究通过提取溶剂、分离色谱柱及检测波长的选择、梯度洗脱条件的优化，建立了一种利用液相色谱同时测定肥料中6-苄氨基嘌呤、吲哚乙酸、脱落酸、吲哚丁酸、萘乙酸、氯吡脲、2，4-D、烯效唑8 种植物生长调节剂的方法。该方法前处理简便快捷，检测结果准确度高；利用液相色谱为分离手段，通用性强；在实验室大批量样品检测时，将快速提高检测效率，可为肥料产品中植物生长调节剂的风险监控和风险评估提供技术支撑。