袁橙 樊雪 王永娟 郭长明 董亚青 高晓茜

摘要：蛋雞生产中，鸡舍水线的微生物含量是否达标与蛋鸡发病率、产蛋效率、产蛋质量等密切相关。为客观评价养殖常用消毒剂的消毒效果，合理制订蛋鸡养殖行业水线消毒程序并进行实践检验，选取7类养殖生产中常用的消毒剂进行水样消毒效果检测，据此制订蛋鸡场水线消毒方案，并在江苏省姜堰华杰养殖有限公司鸡舍内开展水线消毒方案的实施和效果评价。研究发现，三氯异氰尿酸、溴化二甲基二癸甲基烃铵、过氧化物类消毒剂能有效杀灭水样内所有微生物。使用三氯异氰尿酸粉对蛋鸡舍水线的消毒效果研究显示，依据国家标准，消毒前鸡舍水线菌落总数及大肠菌群不合格;对比2021年1月和5月两次实施水线消毒方案的效果评价结果发现，三氯异氰尿酸粉用于蛋鸡舍水线消毒效果较好，但在气温较高的季节应缩短消毒间隔至2 d内，每轮消毒中需重复用药3次以上才能取得较好的消毒效果。

关键词：蛋鸡;消毒剂;水线微生物;三氯异氰尿酸

中图分类号：S831文献标识码：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.03.002

Study on Disinfection Effect of Common Disinfectants on Water Line in Laying Hens farm

YUAN Cheng，FAN Xue，WANG Yongjuan，GUO Changming，DONG Yaqing，GAO Xiaoqian

（Agricultural and Animal Husbandry Science and Technology Vocational College，Taizhou Jiangsu 225300，China）

Abstract：Whether the microbial content of the waterline in the chicken house is up to standard is closely related to the incidence rate of laying hens，laying efficiency and egg quality. In order to objectively evaluate the disinfection effect of commonly used disinfectants in breeding，reasonably formulate the water line disinfection procedure in laying hens breeding industry and carry out practical test，select 7 kinds of disinfectants commonly used in breeding production to test the disinfection effect of water samples，and formulate the water line disinfection scheme of laying hens farm，The implementation and effect evaluation of waterline disinfection scheme were carried out in a hen house of JiangyanHuajie breeding Co.，Ltd.in Jiangsu Province. It is found that trichloroisocyanuric acid，dimethyl decyl methyl ammonium bromide and peroxide disinfectants can effectively kill all microorganisms in water samples. The study on the disinfection effect of trichloroisocyanuric acid powder on the waterline of egg hen house showed that compared with the national standard，the total number of colonies and coliform group of waterline of chicken house before disinfection were unqualified;Compared with the effect evaluation of the waterline disinfection scheme implemented twice in January and may 2021，it is found that trichloroisocyanuric acid powder has a good effect on the waterline disinfection of egg hen houses，but in the season with high temperature，the disinfection interval should be shortened to 2 days，and it needs to be repeated for more than 3 times in each round of disinfection to achieve a good disinfection effect.

Keywords：layer，disinfectant，waterline microorganisms，trichloroisocyanuric acid

0引言

中国的蛋品产量与消费量世界第一。据统计，中国蛋品产量约占全球产量的40%[1]。随着养殖技术和设备的更新发展，鸡场的饮水系统由开放式水槽逐步更新为封闭式水线。水线系统相对于开放式水槽具有较好的密封性，可有效减少环境中污物的进入。但也正因其封闭性，管理人员不易观察到水线内卫生状况，管内易形成生物膜且难以清除，造成水线内部微生物超标[2]，引发鸡体肠道健康问题，降低产蛋效率和质量[3]。易产生沙壳蛋和软壳蛋，还会增加交通运输中鸡蛋损耗。研究显示，有效的水线消毒程序可减少甚至消灭水线内的病原微生物，降低鸡场传染性疾病、消化道疾病的发病率和鸡群的死淘率[4]。

2020年5—12月，笔者依托江苏省蛋鸡产业体系项目通过问卷调查及采样检测等方法，对江苏省45个蛋鸡养殖场的消毒工作进行了系统评估。调查发现，大部分养殖场并未制订或坚持定期实施科学的鸡场消毒程序，有些鸡场甚至从不进行水线消毒，导致蛋鸡场水线菌落总数合格率和大肠菌群合格率仅为41.2%和54.1%，沙门氏菌合格率为85.8%。因此，对酸化剂类、过氧化物类、碘制剂、碱类、氯制剂、醛类和表面活性剂等常用消毒剂的消毒效果进行对比研究，筛选出适用于水线微生物消毒的消毒剂，并据此制订水线微生物控制技术熟化方案、检验方案在不同气温条件下的消毒效果，对于科学指导鸡场开展水线消毒等工作具有重要意义。

1材料与方法

1.1材料

（1）菌种来源。大肠杆菌菌株由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存[5]，沙门氏菌菌株由作者从淮阴、海安等地蛋鸡养殖场源头水、水线水中分离并保存。

（2）主要试剂。结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、菌落总数测试片、沙门氏菌显色培养基、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）、大肠菌群测试片、LB液体培养基、平板计数琼脂（PCA）均购于北京陆桥技术股份有限公司;三氯异氰脲酸粉（有效氯30%，终浓度有效率0.16%）等购自山东中抗药业有限公司。引物合成和测序由苏州金唯智生物技术有限公司完成;DNA聚合酶等试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1国标法和测试片法一致性评价

复苏实验室保存的大肠杆菌甘油菌，参考李亭玉等[6]的方法将细菌液体培养物进行2次离心洗涤，进行10^-5、10^-6、10^-7、10^-8梯度稀释备用，分别用国标法和试纸片法计数。

（1）国标法菌落总数计数。按照GB4789.2—2016《食品安全國家标准食品微生物学检验》[7]进行菌落总数测定。

（2）国标法大肠菌群计数。按照GB4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验》网进行大肠菌群测定。

（3）测试片法菌落总数和大肠菌群计数。使用菌落总数测试片和大肠菌群测试片进行检测。揭开测试片表面透明覆盖薄膜，吸取1 mL稀释好的大肠杆菌菌液垂直悬空滴加于测试纸片上。样品充分在测试片上扩散后缓缓盖上上层透明覆膜，将四周气体排空，检查膜是否封好。标记样号、时间，等待1 mm让样品在培养基中充分扩散吸收。测试片的透明面朝上，置于密闭盒子中防止水分蒸发，置于37 ℃培养箱培养24 h。

1.2.2养殖场消毒剂消毒效果比较

从养殖场获取酸化剂类、过氧化物类、碘制剂、碱类、氯制剂、醛类和表面活性剂这7类常用消毒剂的商品，在实验室条件下，按照各商品的使用说明，分别检测消毒剂对10 mL水样（菌落总数1 721 CFU/mL、大肠菌群89 CFU/mL）的消毒效果。

1.2.3鸡舍水线消毒程序

鸡舍晚上熄灯后放空水线，按水和三氯异氰脲酸粉为180 ：1的质量比在水箱中添加消毒剂，并放水充满水线管道，浸泡过夜。第2 d清晨开灯前放空水线，并用清水反向冲洗水线至少2遍。消毒后96 h （第4 d晚间），重复以上操作，进行下一轮消毒。

1.2.4鸡舍水样采集

1月进行产蛋鸡舍消毒1轮效果检测。分别采集未消毒、消毒后第1 d、消毒后第2 d、消毒后第3 d、消毒后第4 d、消毒后第7 d、消毒后第11 d、消毒后第15 d的水样。

5月进行青年鸡舍和产蛋鸡舍消毒3轮效果检测。分别采集未消毒、第1次水线消毒后第2 d、第1次水线消毒后第3 d、第2次水线消毒后第1 d、第2次水线消毒后第2 d、第3次水线消毒后第1 d、第3次水线消毒后第2 d的水样。

采集进行试验鸡舍内的水箱水、水线前端乳头水、水线后端乳头水。具体方法为用无菌离心管抵住乳头采集水样，每个采样点各采集10 mL （n=3），放于4 ℃保存备检。

1.2.5水线水样微生物检测

（1）水样菌落总数检测。对水样进行10倍和100倍稀释，每个稀释度做3个重复，用测试片法检测。选择菌落密度适宜的水样检测测试片进行菌落计数。将测试片上显示红色的菌落记为菌落总数。结果判定依据GB-5749—2006《生活饮用水卫生标准》，菌落总数（CFU/mL）≤100为合格。

（2）水样大肠菌群检测。对水样进行10倍和100倍稀释，每个稀释度做3个重复，用测试片法检测。选择菌落密度适宜的水样检测测试片进行菌落计数。将测试片上显示蓝色的菌落记为大肠菌群。结果判定依据GB- 5749—2006 《生活饮用水卫生标准》和世界卫生组织《饮用水水质准则》第三版，饮用水中总大肠菌群不得检出。

（3）水样沙门氏菌检测。采用PCR法检测水样中的沙门氏菌。取50 gL待检水样与5 mL缓冲蛋白胨水（BPW）混匀后加入增菌管中，37 ℃摇床200 r/min振荡培养12 h后取100 μL菌液，10^-4稀释后取100 μL稀释后菌液，涂布于沙门氏菌显色培养基培养16 h。挑取10个疑似沙门菌氏的紫红色单菌落，接种于沙门氏菌显色培养基培养16 h。挑取平板上单菌落，接种于3 mLBPW振荡培养过夜[9]。

从每管培养物中取2 mL菌液离心洗涤，沉淀中加50 μL无菌纯水重悬后煮沸15 mm。样品高速离心后取上清作为PCR检测模板。根据文献[10]合成沙门氏菌16SrDNA特异性片段扩增引物，配置PCR反应体系。PCR反应程序为95 ℃作用5 min;95 ℃作用45 s，58 ℃作用30 s，72 ℃作用30 s为1个循环，共执行30个循环;72 ℃作用10 mm。同时设置沙门氏菌DNA模板阳性对照和无菌纯水阴性对照。

运用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。阳性对照反应产物有152 bp条带，阴性对照反应产物无条带，试验成立。此时如检测样品反应产物中出现152 bp条带，则判定为沙门氏菌阳性，否则为阴性。依据GB—5749—2006《生活饮用水卫生标准》，沙门氏菌不得检出。

2结果

2.1检测方法的一致性评价结果

用国标法和测试片法分别检测10^-5、10^-6、10^-7、10^-8稀释度的大肠杆菌，其中10^-5、10^-6稀释度多不可计，10^-5、10^-6、10^-7、10^-8稀释的菌落数量，见表1。平板法计算得菌落总数及大肠菌群分别为1.05×10⁹CFU/mL和1.0×10⁹CFU/mL;测试片计算得菌落总数及大肠菌群分别为1.08×10⁹CFU/mL和1.11×10⁹CFU/mL。根据《食品安全国家标准食品微生物学检验》推荐的平板法与商品化测试片的检测出的菌落数量在计数误差范围内，结果具有一致性，表明测试法亦可用于菌落计数。

2.2养殖场消毒剂消毒效果比较

7类消毒剂对已知菌落总数和大肠菌群水样的消毒效果检测结果，见表2。从检测结果可以看出酸化剂类产品中，枸橼酸、DL-苹果酸无消毒杀菌效果，甲酸盐、丙酸盐等盐可在短时间内（30 min）产生较好消毒效果，而其他复合酸与水作用24 h后虽可抑制微生物生长，但是消毒效果不能达到100%。三氯异氰尿酸、溴化二甲基二癸甲基烃铵、过氧化物类能在24h内完全抑制微生物生长。聚维酮碘、二氯异氰脲酸钠、醛类、水管疏通剂虽然在24h内对水源微生物的抑制率未达到100%，但是能使微生物指标符合国家标准。小苏打（碳酸氢钠）24 h的消毒作用较弱。同时发现，不同厂家的消毒剂，虽然标注的主要成分相似，但消毒效果并不一致。

2.31月鸡舍水线消毒效果

1月产蛋鸡舍水线消毒前后均未检测出沙门氏菌，菌落总数和大肠菌群检测结果检测结果，见表3。根据《水源微生物检测方案》中微生物判断标准，在消毒前水线中菌落总数和大肠菌群均不达标;在第1次消毒后水线内菌落总数和大肠菌群均合格;水线前端水样菌落总数和大肠菌群第7 d出现增长趋势;水线后端水样在第4 d菌落总数和大肠菌群出现增长趋势。见图1和图2。

2.45月鸡舍水线消毒效果

5月水线消毒前后均未检测出沙门氏菌，菌落总数和大肠菌群检测结果，见表4。根据前述结果判定标准，消毒前水箱内的水源菌落总数和大肠菌群均合格，但是水线内菌落总数及大肠菌群未能全部达标。第1次消毒后各鸡舍水线內菌落总数和大肠菌群均合格。第1 次消毒后3 d水样菌落总数只有产蛋鸡舍前端水线合格，其他均不合格。因大肠菌群在消毒后3 d有明显的回升，故之后改为每隔2 d进行1次消毒，消毒后24 h采集水样检测发现，菌落总数和大肠菌群除产蛋鸡舍后端水样不合格，其他样品均合格。消毒前后各鸡舍菌落总数和大肠菌群变化趋势，见图3和图4。

3讨论

测试片利用特异性酶与特异性显色底物反应的原理，使目标菌与非目标菌呈现可明显区别的不同特异性颜色[11]，可极大地方便细菌检测计数。两种方法的一致性评价显示，测试片法的计数结果与国标法具有一致性。相比而言，测试片法操作程序更为简单，可有效降低检测成本、缩短检测时间。

对消毒剂消毒效果的比较研究发现，甲酸盐、丙酸盐、三氯异氰尿酸、漠化二甲基二癸甲基烃铵和过氧化物类消毒剂对水样的消毒效果最好，而现阶段养殖生产上流行使用的酸化剂，在本实验条件下几乎没有杀灭大肠杆菌等细菌的作用。虽然有研究显示添加饮水型酸化剂可提高蛋鸡免疫力、缓解肝脏损伤和肾脏损伤[12]，对增加蛋重、蛋壳厚度和蛋壳强度，维持蛋鸡输卵管健康亦有一定的作用[13]，但是本研究的结果证明酸化剂并无杀菌效果，不适用于水线消毒。

有研究人员检验了三氯异氰尿酸对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌黑色变种芽孢的杀菌效果。发现当三氯异氰尿酸浓度在75 mg/L以上时，可在15 mm内杀灭3种细菌悬液中99.9%以上的菌体[14]。该研究中，三氯异氰尿酸粉消毒水线前后的水样检测结果显示，5月水线中细菌滋生速度明显高于1月，可能与气温升高利于微生物繁殖等原因有关。提示冬季使用三氯异氰尿酸粉按照4 d一个周期进行消毒，可有效降低水线微生物数量，同时抑制水线中微生物的繁殖。5月水线消毒采用1月的消毒方案，出现微生物在第3 d即超标的问题。因此，蛋鸡养殖中夏季水线消毒频率要高于冬季，宜缩短消毒间隔至2 ～内，消毒中需重复用药3次以上以维持消毒效果。

4结束语

通过使用7种不同的常用消毒剂进行水样消毒检测，结果表明，只有三氯异氰尿酸、漠化二甲基二癸甲基烃铵、过氧化物类消毒剂能有效杀灭水样内所有微生物。其中三氯异氰尿酸粉更适用于鸡舍水线消毒。筛选并确定了3种有效灭杀蛋鸡舍微生物的消毒剂，为产蛋鸡舍灭杀微生物，提供科学数据和合理方案。

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