王福鑫 矫筱蔓 赵志龙 史延通

【摘要】目的：发现潜在可用于保湿功效评价体外研究新靶点。方法：通过GEO数据库收集正常人体皮肤数据和因皮肤保湿功能异常引起的与疾病相关的基因数据，利用GEO2R对两者基因数据进行差异分析，得到潜在与皮肤保湿相关的差异基因;再利用STRING关联丝聚蛋白基因（Filaggrin，FLG）与其他差异基因，在GeneCards数据库进行GO/KEGG富集分析，并将这些基因的生物学功能与得到的信号通路关联，阐释潜在靶基因的现实意义。结果：与丝聚蛋白基因强相关的基因有FGF1、KLK5和CASP14等。结论：FGF1、KLK5以及CASP14可作为潜在靶点化妆品保湿功效评价体外研究，具有进一步验证开发的前景。

【关键词】化妆品;生物信息学;丝聚蛋白;功效评价

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2022.03.017

Discovery of Potential New Targets for Moisturizing Efficacy Evaluation of Cosmetics by Bioinformatics

WANG Fu-xin，JIAOXiao-man，ZHAO Zhi-long，SHI Yan-tong

（Liaoning Institute of Drug Control，Shenyang 110036，China）

Abstract：Objective：Aiming to find potential new targets in vitro for moisturizing efficacy evaluation. Methods：Normal human skin gene data and gene data related to diseases caused by abnormal skin moisturizing function were collected through GEO database，the difference analysis between them was analyzed by GEO2R to obtain different genes;STRING was used to associate FLG and differential genes. GO and KEGG enrichment analysis were carried out with GeneCards database. The biological functions of these genes are associated with the obtained signal pathways to explain the practical significance of potential target genes related to skin moisturizing. Results：FGF1，KLK5 and CASP14 genes were strongly related to FLG gene. Conclusion：Potential targets as FGF1 KLK5 and CASP14 are thought to be prospective for the evaluation of moisturizing efficacy of cosmetic study in vitro which are required for further validation and development.

Key words：cosmetic;bioinformatics;Filaggrin;efficacy evaluation

皮膚是人体抵御外界侵袭的第一道屏障。它有助于保护人体免受细菌等有害物质的侵害。皮肤时刻都在更新，这样可维持屏障的保护功能。然而，各种不利因素会损害皮肤屏障自我维持和修复的能力。皮肤的保湿能力尤为重要。由于皮肤老化或环境因素导致皮肤角质层增厚，屏障能力减弱，具体表现为：皮肤干燥，易受感染、刺激和过敏，以及其他相关的不良后果，如皮肤病、皮肤癌变等。皮肤需要足够的水化水平来维持表皮屏障的完整性和正常的功能活动。

支持皮肤水合作用的三个关键因素包括：天然保湿因子（Natural Mosterizing Factor，NMF）、皮肤脂质双层和透明质酸（HA）。三者共同促进、维持表皮和皮下结构的保湿功能，以确保皮肤形成健康的屏障。其中，NMF由一组高效的保湿组分组成，这些组分吸引和结合大气中的水分，对角质层中的水分保持至关重要。NMF是Filaggrin在角质层浅层转化的产物，Filaggrin是一种位于角质层角细胞层的大蛋白，分布于胞浆中（如图1）。FLG基因翻译表达的丝聚蛋白前体（Profilaggrin）经降解为丝聚蛋白（Filaggrin）。

Filaggrin水解取决于角细胞内的水活性以及外部相对湿度，并且只能在角细胞内的一个狭窄的水活性范围内发生，如果暴露在紫外线辐射下会损害Filaggrin，自然降解为NMF的发生。NMF的成分主要是氨基酸和氨基酸衍生物，如吡咯烷酮竣酸（PCA）、乳酸和尿素。乳酸刺激合成神经酰胺，改善预防与干燥相关的症状;尿素刺激合成神经酰胺和水通道蛋白（Aquaporin 3，AQP3）相关酶的表达。这也侧面说明AQP3与Filaggrin间接相关。随着皮肤保湿机制相关研究的深入，一些对AQP3、透明质酸合成酶等靶点已被大家熟知，挖掘其背后与FLG及其相关的基因，对研究具有保湿功效的化妆品及其原料有十分重要的应用价值。

生物信息学是一门利用计算机技术研究生物系统规律的学科。随着生命科学和计算机科学的迅猛发展，使用信息学技术可在大分子层面理解和组织与生物大分子相关的信息。利用已有临床公开数据，进行收集、分析遗传数据，并利用计算机技术和统计学方法，建立“生物学现象一寻找靶点一关联聚类一生物学意义”的研究思路，为探索新的化妆品保湿功效体外评价方法发现潜在新靶点。

1实验方法

1.1皮肤数据的获取

利用Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以 dermatitis、atoptic dermatitis作为关键词检索皮肤数据。按照与皮肤失水相关因素进行筛选，选择芯片数据GSE32924中的样本进行分析，把选择的样本分为两组：对照组和实验组（皮肤异常组）。数据用Excel软件进行统计及数据转换。

1.2差异分析

将GSE32924的选择样本导入GEO2R差异表达分析软件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）进行差异分析，得到的数据与FLG相关联基因用Excel整理后，利用Prism 9.0软件进行火山图和热图的分析，得到差异基因若干。

1.3交互网络的构建

以FLG基因为靶点，在GeneCards（https：//www.genecards.org/）上查询其已知的关联网络图，借用STRING分析得到FLG的关联網络。

1.4GO/KEGG通路富集分析

GO富集分析通过GeneCards，得到潜在作用靶点（FLG的交互网络得到的相关基因）的GO富集结果，明确潜在靶基因所参与调控的生物学过程、细胞构成及分子功能。

2结果

2.1差异基因分析

将GEO收集到的皮肤数据经过GEO2R差异分析后，按照p值由小到大顺序排列，其升高降低的基因见图2，之后把前45个p值差异显著的基因列出备选。

2.2交互网络

由于此前FLG在皮肤水合起到重要作用，因此，采用STRING的交互网络进行分析，如图3。

该交互网络与此前GEO2R的差异分析进行综合比对，把与皮肤保湿相关的靶基因一起进行热图分析后发现，GEO2R差异分析得到的前45个基因（按p值从小到大排序）与FLG密切相关的基因（取经筛选有相关生物学意义的基因：KLK5，FGF1和CASP14）相比，后者的在两组样品对比中有较大差异，如图4。

2.3GO/KEGG通路富集分析

研究使用GeneCards检索由差异分析及交互网络得到潜在靶点进行GO富集分析，包括：生物学过程（Biological Process，BP）、细胞构成（Cellular Component，CC）以及分子功能（Molecular Function，MF），以阐释这些潜在靶点参与生命过程。结果显示：这些潜在靶点主要通过参与人体多细胞生物发育（Multicellular Organism Development）、角质形成细胞分化（Keratinocyte Differentiation）、皮肤屏障的建立（Establishment of Skin Barrier）、角质化（Cornification）等生物学过程发挥作用。在细胞构成方面主要与细胞质（Cytoplasm）有关。分子功能方面主要涉及肽交联（Peptide cross-linking）等。由KEGG通路富集分析，获得FLG及相关靶基因交互关联的信号通路10条（见表1）。结果显示：FLG 及其关联的基因对皮肤保湿效果影响显著的信号通路为肌动蛋白细胞骨架的调节（Regulation of actin cytoskeleton）、FGFR1 在疾病中的信号转导（Signaling by FGFR1 in disease）和MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）等。

3讨论

FGF1被称为修复之王，它在人体内皮细胞胞质中高选择性表达。该基因编码的蛋白质是成纤维细胞生长因子（FGF）家族的成员（见图5）。FGF家族成员参与多种生物学过程，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和侵袭等。

现阶段对FGF1的研究表明，FGF1具有很强的修复作用。它能主动与伤口附近细胞膜上的特异性受体相结合，从而激活蛋白酶，加快蛋白质的合成，促合皮肤和黏膜创面愈合并减少疤痕收缩和皮肤的畸形增生，快速高效修复受损皮肤。FGF1还可通过提高机体细胞免疫活性，抑制局部炎症发生。这对抑制粉刺生长，保护皮肤免受不良环境因素的损伤十分有益。不仅如此，FGF1还可促进表皮成纤维细胞的分裂，加速合成胶原纤维、弹性纤维和HA等，对改善皮肤细胞萎缩、补充水分效果显著。FGF1也可促进堵塞或消失的毛细血管内皮细胞新生、皮肤血管网增多、血流增加、增加皮肤营养输送。组织激肽释放酶5（Kallikrein 5，KLK5），是丝氨酸蛋白酶的一个亚类，具有多种生理功能（见图6）。

丝氨酸蛋白酶与Profilaggrin共同存在于颗粒层，由板层颗粒分泌。KLK5在Filaggrin的生成方面起着重要作用。KLK5可水解Profilaggrin生成Filaggrin，进而产生由Filaggrin引发的皮肤的多种生物学效应。CASP14即Caspase-14，是指CED-3半胱氨酸蛋白酶家族（见图7）。Caspase-14是表达在表皮层的蛋白酶，负责在表皮上层集中角蛋白和其他蛋白质等形成角质层。Caspase-14可降解Filaggrin为NMF、tUCA、PCA等小分子物质。如果缺失Caspase-14那么人的皮肤会出现角质层缺陷，容易失水，也更容易受到紫外线损伤。

本研究创新性地利用生物信息学为工具，筛选化妆品功效评价体外研究新靶点。后续研究可继续围绕以上三个靶点进行信号通路及表达水平的体外试验方案设计及验证，以构建完整的相关评价方法并开展实际应用，对化妆品其他功效评价研究也可利用生物信息学的方法进行开发验证以得到新的靶点。

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