马路凯，崔 芸，刘芯如，柳建良，肖更生，陈海光，刘袆帆，利新红

(1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室，广州 510225； 2.仲恺农业工程学院 现代农业工程创新研究院，广州 510225； 3.集美大学 食品与生物工程学院，福建 厦门 361021； 4.梅州市梅县区农业科学研究所，广东 梅州 514000)

柚子是柑橘的主要栽培类型之一，富含多酚、黄酮等活性物质，营养价值高，风味独特，且有较好的抗氧化能力[1]，其中尤以梅州柚品质较佳，有“中华名果”“岭南十大佳果”的称号[2]。随着柚子种植面积的增大，产生较多的副产物，如次果、坏果、落果等非鲜食果，以及柚核、柚子皮等。关于柚子副产物的提质利用目前已引起国内较多科研工作者的关注。有研究者发现柑橘类籽粒油脂含量高(40%以上)[3]，可以作为新型油脂资源，且其油脂富含亚油酸、油酸，具有很高的药用价值[4]。柚子籽油中还含有一定量的生育酚、角鲨烯等脂溶性营养物质，诸多研究表明这些脂溶性营养物质具有抗氧化、抗癌、提高免疫、降血脂及改善炎症反应[5-7]等重要功能。因此，提高这些脂溶性营养物质的含量能提高柚子籽油的利用价值。

目前，有学者通过基因工程调控[8-9]、快中子辐照诱发突变[10]方式来提高油料种子(如大豆)的生育酚含量。这些方式程序烦琐，最重要的是品种品质差异性受到争议。近年来，通过超声诱导发芽提高油料种子中营养物质含量成为国内外的研究热点之一。有研究表明超声处理提高了大豆的发芽率，改善了豆芽可食性和营养品质[11]。在种子发芽过程中，会引发一系列代谢变化，减少抗营养因子，提高功能因子[12]。已有研究表明发芽能提高大豆中生育酚的含量[13]；李淑莹[14]研究发现花生在避光发芽过程中，不仅保持了花生的质量，而且花生油中脂溶性营养物质白藜芦醇(苷)、生育酚、植物甾醇和多酚等的含量均显著升高。但是目前鲜见国内外关于发芽过程中柚子籽油脂溶性营养物质变化的研究。

本研究以梅州金柚柚子籽为原料进行超声诱导发芽实验，研究发芽后柚子籽油中主要脂溶性营养物质生育酚、角鲨烯含量的变化规律，结合柚子籽得油率及柚子籽油脂肪酸组成、酸值、过氧化值评价发芽过程中柚子籽油的营养变化，探讨其利用价值，以期为开发高品质安全油脂提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

市售金柚(沙田柚)的柚子籽，产自广东梅州；α-、β-、γ-、δ-生育酚标准品，Sigma公司；角鲨烯标准品，阿拉丁公司；石油醚、正己烷、异辛烷、无水乙醇、酚酞、氢氧化钠、冰乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠等均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

FA3204B电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；YB-700A高速多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；RV10 KA旋转蒸发仪，艾卡(广州)仪器设备有限公司；7890A-5975C气相色谱质谱联用仪(GC-MS)，美国Agilent公司；MesoMR23-040H-1核磁共振成像分析仪，上海纽迈电子科技有限公司；HX-650E智能型超声波细胞破碎仪，上海沪析实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超声诱导柚子籽发芽

筛选外观饱满、大小一致、无霉变的新鲜柚子籽，用蒸馏水清洗去除表面杂质，剥去外壳，并装入烧杯中，加入蒸馏水没过柚子籽1 cm，置于装有蒸馏水的玻璃容器中。将超声波细胞破碎仪的变幅杆伸入玻璃容器中部，调节以使功率分别为0、90、180、360 W，于25℃下避光超声，超声时间分别为0、10、20、30 min。超声结束后将柚子籽于25℃避光浸泡6 h，取出，于25℃、95%湿度下避光发芽，每隔2 d喷淋蒸馏水，时间持续2 min。整个发芽周期为9 d，每隔1 d取样，冷冻干燥，粉碎后过0.42 mm(40目)筛，置于-80℃冰箱保存待用。发芽率(F)按下式计算。

F=n1/n×100%

(1)

式中：n1为柚子籽发芽个数；n为柚子籽总个数。

1.2.2 柚子籽油的提取

取经过1.2.1处理后的柚子籽粉于提取瓶中，按料液比1∶5加入石油醚，在45℃下浸提2 h，冷却后过滤，将滤液在60℃旋蒸除去溶剂，即得柚子籽油，避光储存于4℃冰箱中待用。柚子籽得油率(W)按下式计算。

W=m1/m×100%

(2)

式中：m1为柚子籽油的质量，g；m为柚子籽粉的质量，g。

1.2.3 核磁共振成像技术

参考文献[15]的方法进行核磁共振成像。实验条件为：共振频率23.312 7 MHz，磁体强度0.5 T，线圈直径60 mm，磁体温度(32.00±0.01)℃。利用标准样进行预扫描，寻找磁场中心频率及磁场脉冲宽度，利用SE脉冲序列获得样本质子密度加权像。成像的主要参数为：FOV Read 100 mm，FOV Phase 100 mm，TR 1 500 ms，TE 20 ms，Slices 7，Slice Width 3 mm。实验样本垂直于玻璃试管放置，采集样本冠状面(coronal)图像，获取柚子籽纵向信息。

1.2.4 脂肪酸组成的测定

油脂甲酯化[16]：称取0.50 g柚子籽油，加入1 mL 2.0 mol/L的KOH甲醇溶液，振荡反应5 min后加入1 mL饱和氯化钠溶液和1 mL正己烷，振荡萃取后，以5 000 r/min离心2 min，取正己烷层，加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液过0.22 μm微孔滤膜，用气相色谱质谱联用仪测定。

气相色谱条件[17]：DB-1毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升温程序为柱温100℃保持5 min，以10℃/min的速度升至200℃，保持5 min，以5℃/min的速度升至220℃保持10 min；进样口温度220℃；载气(He)流速1.0 mL/min；进样量0.5 mL。质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度350℃。

经NIST质谱谱库检索匹配，以不低于90%的匹配度确定各脂肪酸组分，采用峰面积归一化法进行定量。

1.2.5 基本理化指标的测定

酸值的测定参考GB 5009.229—2016中的冷溶剂指示剂滴定法，过氧化值的测定参考GB 5009.227—2016中的滴定法，水分含量的测定参考GB 5009.3—2016。

1.2.6 生育酚、角鲨烯含量测定

生育酚含量的测定参考GB 5009.82—2016《食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定》第一法，角鲨烯含量的测定参考LS/T 6120—2017《粮油检验 植物油中角鲨烯的测定 气相色谱法》。

1.2.7 数据处理

所有实验测定均进行3次重复，结果用“平均值±标准偏差”表示。采用Excel 2010软件统计分析数据，运用Origin 2017软件作图，显著性分析采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 超声功率及超声时间对柚子籽发芽率的影响

超声波技术是一种快速、无损有效打破种子休眠状态的方法[18]，超声处理能使种子表面软化，改变细胞壁的结构和细胞膜的通透性，增强细胞活力，对于种子的发芽率和生长发育具有积极影响[19]。在不同超声功率及超声时间下，发芽9 d时的柚子籽发芽率如图1所示。

注：不同大写字母表示同一功率不同超声时间下柚子籽发芽率差异显著(P<0.05)；不同小写字母表示同一时间不同超声功率下柚子籽发芽率差异显著(P<0.05)。

由图1可知，柚子籽发芽率随着超声功率的增加和超声时间的延长显著提高。超声波的机械作用及空穴作用产生的微流效应可以提升生物体系的传质及液体混合，从而提高了生物反应的速度。在超声功率为90～180 W范围内，柚子籽发芽率随着超声时间的延长而显著提高。但在超声功率为360 W时，超声20 min和30 min时的发芽率没有显著变化，发芽率分别为95.42%、95.34%，可能原因是达到一定的临界范围后，超声波对柚子籽发芽不再具有促进作用。Yaldagard等[20]研究发现，在超声功率460 W、超声时间5～10 min条件下，大麦种子发芽率由93.3%显著提高到了99.4%。因此，本研究选用超声功率360 W、超声时间20 min条件下处理的柚子籽样品进行后续实验。

2.2 发芽对柚子籽得油率的影响

发芽对柚子籽得油率及水分含量的影响如图2所示，柚子籽发芽核磁成像如图3所示。

由图2可知：未发芽柚子籽得油率为(55.74±0.15)%；发芽前3 d柚子籽得油率无显著差异(P>0.05)，4～6 d时柚子籽得油率有所下降，7 d时得油率显著下降，9 d时得油率为(52.18±0.01)%，与未发芽柚子籽相比，下降了3.56百分点。此结果与杨选等[21]研究花生籽粒在发芽过程中粗脂肪含量显著降低的结果相似。另外，柚子籽发芽过程中，水分含量显著上升。

注：同一指标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由图3可知，在柚子籽边缘呈现明显的水分信号时，芽胚的基部也呈现较为明显的水分信号，随着发芽时间的延长，籽粒边缘和芽胚的水分信号逐渐增强。有研究发现物料的游离水和外层结合水会影响油脂的提取率，水分含量较高时，物料表面会形成一层水膜，影响油脂溶出[22]，因此柚子籽得油率的下降可能与发芽过程中水分含量升高有关。也有研究指出种子胚中蛋白质和脂肪含量较高，发芽过程种子内部代谢加强，营养物质被分解的同时种胚吸收这些被分解的物质，从休眠状态恢复活性，细胞恢复生长[23]，所以柚子籽得油率下降可能是柚子籽进行呼吸作用时，脂肪发生了分解代谢,为其发芽提供了能量。

图3 柚子籽发芽核磁成像

由表1可知，柚子籽油主要含棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸5种脂肪酸。发芽过程中柚子籽油饱和脂肪酸含量由30.94%增加到31.21%，其中：棕榈酸含量在发芽前3 d内无显著变化，此后几天显著升高；而硬脂酸含量在柚子籽发芽过程中由3.52%降至3.31%。在柚子籽发芽过程中柚子籽油不饱和脂肪酸含量呈现逐渐降低的趋势，由69.03%降低到68.78%，其中油酸含量在发芽过程中有所升高，亚油酸和亚麻酸含量均呈现下降趋势。在整个柚子籽发芽过程中柚子籽油脂肪酸组成没有变化。

表1 发芽对柚子籽油脂肪酸组成的影响

有研究发现，芝麻在萌发至72 h过程中亚油酸含量减少，芝麻萌发前后主要脂肪酸组成类别无变化[24]，此结果与本研究相似。这可能是因为脂类主要以三酰基甘油的形式储存，在发芽过程中有少部分水解为游离脂肪酸和甘油，扩散到线粒体基质，氧化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环提供能量，而碳水化合物是萌发过程中主要的能量来源[25]。在柚子籽9 d的发芽过程中，柚子籽油不饱和脂肪酸中的油酸含量升高了0.36百分点，亚油酸含量下降了0.50百分点，亚麻酸含量下降了0.14百分点，说明发芽使柚子籽油氧化稳定性有所提高。

2.4 发芽对柚子籽油酸值及过氧化值的影响(见图4)

注：同一指标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同

酸值、过氧化值是评价油脂质量的重要指标。酸值反映油脂发生水解反应后游离脂肪酸含量[26]；过氧化值在一定程度上反映了油脂氧化变质的程度[27]。由图4可知，柚子籽发芽过程中柚子籽油的酸值显著升高，过氧化值前5 d也显著升高，发芽5 d时柚子籽油的酸值(KOH)、过氧化值分别为(1.19±0.04)mg/g、(1.98±0.02)mmol/kg，满足GB 2716—2018《食品安全国家标准 植物油》中植物原油的限量标准。

2.5 发芽对柚子籽油生育酚、角鲨烯含量的影响(见图5)

图5 发芽对柚子籽油生育酚、角鲨烯含量的影响

生育酚是存在于植物油脂中的天然抗氧化剂，在油脂中起着重要的作用。由图5可知，未发芽时柚子籽油中生育酚含量不足60 μg/g，随着发芽时间的延长，生育酚含量显著增加，发芽5 d时达到了峰值，为(265.29±0.05)μg/g，与未发芽时相比，生育酚含量增长了3.74倍。因此，发芽可以显著提高柚子籽油的生育酚含量。生育酚含量在柚子籽发芽5 d后显著下降，可能是因为生育酚的分解或转化。李淑莹等[28]研究花生发芽过程中生育酚含量变化发现，发芽后生育酚含量显著提高，为原料中的3.25倍。也有研究发现芝麻种子萌发过程中α-生育酚含量前5 d显著升高,第6天时下降[29]。Li等[30]研究发现，亚麻籽萌发前5 d，亚麻籽油总生育酚含量呈先增加后下降的变化趋势，总生育酚含量的增加是由于生育酚的合成是幼嫩植株生长的生理代谢物质，降低是后期用作植株生长的促进剂和增效剂。

角鲨烯具有抗衰老、抗肿瘤及提高机体免疫功能的作用[31]。由图5可知，在柚子籽发芽过程中，角鲨烯含量的变化与生育酚一致，也是先显著升高后显著下降。未发芽柚子籽制备的柚子籽油中角鲨烯含量为4.20 μg/g，发芽5 d时达到峰值，为(36.10±0.01)μg/g，与未发芽时相比，增长了7.60倍。同样地，发芽具有提高柚子籽油中角鲨烯含量的作用。Young等[32]研究发现普通水稻、糯米、红色水稻萌发后角鲨烯含量均显著增加。因此，发芽可以提高柚子籽油脂溶性营养物质的含量，也提高了柚子籽油的利用价值。

3 结 论

本文以金柚加工副产物柚子籽为研究对象，采取超声方式诱导柚子籽发芽，用石油醚抽提法提取柚子籽油，考察发芽对柚子籽油品质的影响。结果显示：超声功率为360 W、超声时间为20 min时的发芽率达到95.42%； 9 d发芽过程中柚子籽得油率下降3.56百分点，但仍满足油料的要求；发芽不改变柚子籽油脂肪酸组成且发芽5 d时柚子籽油的酸值(KOH)((1.19±0.04)mg/g)、过氧化值((1.98±0.02)mmol/kg)均符合植物油国家标准；发芽5 d时柚子籽油生育酚((265.29±0.05)μg/g)、角鲨烯((36.10±0.01)μg/g)含量均达到了峰值，与未发芽相比分别增长了3.74倍和7.60倍。综上，发芽不仅能保持柚子籽油的质量，更显著强化了其脂溶性营养物质，提高了柚子籽油的营养价值，开阔了柚子籽油的开发利用领域。