葛启要，张首伟，李西选，张剑侠

（西北农林科技大学园艺学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室/农业农村部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，陕西杨凌 712100）

1889年Neal首次在美国加州的葡萄上发现根结线虫（Meloidogyne spp.）[1]。根结线虫主要有南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫4种[2]，是世界上危害性最强的植物病原线虫之一[3]。除了茄科、瓜类植物受害较严重外，葡萄也常常受到危害[4]。根结线虫侵染性二龄幼虫的侵染会使植株畸形[5]，还会加重枯萎病等土传病害的发生[6]。根结线虫的病症（根结、根腐）比较隐蔽，不易从地上部判断是否感病，且容易与缺素症和病毒病相混淆，因此从植物地上部较难分辨线虫病，从而加剧了防治困难[7]。防治措施不力以及防治困难使得根结线虫病害愈发严重[8]，导致许多葡萄园遭受巨大的经济损失[9]。危害葡萄的根结线虫主要为南方根结线虫，在我国由北方传统葡萄产区向四周迅速扩散，危害范围逐年扩大，已经成为重要的土传病害[9-10]。目前生产上主要采用化学防治、生物防治、轮作等方法进行防治[11]，但栽培抗性品种是最安全、高效、可靠的方式[12]。

我国拥有丰富的野生葡萄资源，抗线虫类型丰富多样[13]，加之从国外引入了大量葡萄栽培品种和砧木等资源，其中有很多是抗根结线虫的资源类型[13-15]。迄今，我国在抗南方根结线虫的葡萄砧木育种方面研究较少。为解决葡萄生产中南方根结线虫危害日益严重的问题，本团队前期利用中国野生山葡萄与北美洲野生葡萄（或砧木品种）开展了砧木杂交育种工作，获得了大量杂种，在此基础上对筛选的36个杂种优株进行南方根结线虫的抗性评价，以期为进一步选育抗南方根结线虫特别是多抗性砧木新品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源

2021年5月23日，从陕西省杨凌示范区大寨乡西小寨村的日光温室采集一定数量的带有根结线虫的甜瓜根结用于试验。

1.1.2 葡萄砧木材料

砧木材料为西北农林科技大学葡萄种质资源圃中保存的6个砧木杂交组合的36个杂种优株的一年生无性繁殖盆栽植株（表1）。以翟衡等[16]鉴定为免疫的砧木品种‘5BB’作为抗性对照（CK1），刘三军等[10]鉴定为高感的栽培品种‘夏黑’作为感病对照（CK2）。

1.2 方法

1.2.1 供试根结线虫的形态学鉴定方法

供试根结线虫虫源种类的确定：参照前人的试验方法[17]，分离出甜瓜根结中的根结线虫，观察卵和二龄幼虫的形态特征并拍照。

供试根结线虫雌虫会阴花纹的制作与观察：随机选取6条病根中的6条雌虫，先后做成6个临时装片[18]，编号，然后将临时装片置于SMZ1500连续变倍实体显微镜带成像系统的载物台上，观察、记录雌虫的会阴花纹特征并拍照。

1.2.2 供试根结线虫的分子生物学鉴定方法

（1）供试根结线虫的DNA提取与PCR扩增。单头根结线虫的DNA提取，采用蛋白酶K法[19]，分别获取6条雌虫组织的DNA溶液。用移液枪分别取每一样品的上清液进行PCR扩增，剩余DNA溶液置于-80 ℃冰箱保存，备用。

采用前人设计的根结线虫ITS扩增通用引物F195和V5367[20]，序列分别为：5'-TCCTCCGCTAAATGATATG -3'和5'-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3'（由杨凌天润奥科生物科技有限公司合成），分别对获取的6条根结线虫DNA的ITS间隔区进行PCR扩增。PCR产物采用1.5%的琼脂糖凝胶，1×TBE作为电泳缓冲液，在紫外灯下观察拍照，剩余的PCR产物于4 ℃保存备用。

（2）PCR产物测序和同源性比较。电泳结束后，回收目标DNA条带，送杨凌天润奥科生物科技有限公司测序。将测定的序列在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中与已报道的南方根结线虫序列进行同源性比对分析。

1.2.3 葡萄砧木材料的准备

2020年3月底将冬季沙藏的葡萄枝条取出，剪成15 cm左右带2或3个饱满芽的插条，上端距离芽眼1 cm剪成平口，下端在芽眼对面剪成马蹄形，每个株系或品种共计30个插条。用1000 mg·L-1的生根粉溶液浸泡葡萄插条的形态学下端15 s，然后露地覆膜扦插，每株系（品种）挂牌，对扦插苗进行常规管理，秋季获得一年生苗。翌年3月初，按照园土∶蛭石∶有机肥＝28∶6∶3的比例配制营养土，装入外口径35 cm的花盆，每个品种（株系）栽植4株，挂牌记录名称，然后浇一次透水，之后进行正常的盆栽苗栽培管理。

高中化学的主要研究内容是从微观的角度研究物质的成分、性质及规律，这在一定程度上决定了化学知识的抽象难懂，导致学生对化学学习充满畏惧心理，不愿意主动配合教师的教学活动，而对于强调逻辑思维和动手能力的化学实验更是敬而远之，导致在化学实验教学中学生的参与性较低，不利于化学实验的有效开展，也不能有效提高学生的科学实验探究能力。

1.2.4 接种

将实验室鉴定为带有南方根结线虫的甜瓜根结，于2021年5月28日对盆栽葡萄砧木杂种优株进行接种。首先将甜瓜受害根部剪成0.5 cm的小段，制备成含有南方根结线虫的根结，每盆称取5 g接种[13]，每株系（品种）接种4株。接种时先在盆中植株的四周挖深约10 cm的坑，将根结放入并覆土，然后浇透水，之后进行正常的盆栽苗栽培管理。

1.2.5 取样

接种80 d后，先把盆栽葡萄植株轻轻倒扣出来，尽量不要损伤根系，取出带有葡萄植株的土团，轻轻触散土团，然后将仍带有较多土团的植株放入水桶中浸泡，待土团完全散开时，轻轻冲洗植株根系，尽量保持根系的完整性。洗净后，晾干根系表面水分，拍照，并调查病情指数。

1.2.6 调查方法与抗性等级划分

每个砧木株系及对照‘5BB’‘夏黑’各调查4株，仔细观察每条根上的根结症状。参照孙海生的方法[14]，将根系的感病程度（严重度）划分为5级：0级，根上无根结；1级，根上有少数根结；2级，根上大部分有根结；3级，根上大部分有根结，并在虫瘤上再次形成根结；4级，根结互相联结成为根结团块。统计同一株系4株的每一根系感病程度，按公式将严重度换算为病情指数，确定其抗性等级。

病情指数＝∑(各病级数×该级根数)/(最高病级数×调查总根数)×100。

抗性等级划分标准参照前人的方法[14]，略有改动，将免疫或极抗改为免疫，其它未做改动。免疫（Immune，I），病情指数为0；高抗（High resistance，HR），0＜病情指数≤10；抗（Resistance，R），10＜病情指数≤20；中等（Middle resistance，MR），20＜病情指数≤40；感（Susceptibility，S），40＜病情指数≤60；高感（High susceptibility，HS），病情指数＞60。

2 结果与分析

2.1 供试根结线虫的鉴定结果

对采集的甜瓜病根中的根结线虫进行形态学鉴定，结果（图1A-D）显示，其卵为长椭圆形或肾形；2龄幼虫呈线状，无色，透明；雌虫乳白色，呈梨形或柠檬形；雌虫的会阴花纹背纹紧密，背弓高，背弓顶部圆或平，有时呈梯形，两侧近乎直角，背面和侧面线纹呈波浪形或锯齿状，有的平滑。观察结果与前人描述的南方根结线虫的特征相一致[21]，初步确认为南方根结线虫（M. incognita）。

2.1.2 供试根结线虫的分子生物学鉴定结果

进一步的PCR分析结果（图1E）显示，供试甜瓜病根中的6条根结线虫DNA，均能扩增出750 bp左右的目标条带。经测序所有样品的ITS序列长度均为703 bp。序列比对结果表明，其与南方根结线虫的ITS区编码序列具高度同源性，达到98.83%，可以确认所获取的根结线虫群体是南方根结线虫群体。

图1 供试根结线虫的形态观察与PCR扩增结果Figure 1 Morphological observation and PCR amplification results of tested root-knot nematodes

2.2 葡萄砧木杂种优株抗南方根结线虫的鉴定结果

对供试葡萄材料抗南方根结线虫的鉴定结果（表1）表明，按照病情指数，对照‘5BB’表现免疫，与翟衡等[16]的结果相一致；对照‘夏黑’表现高感，与刘三军等[10]的结果相一致。供试砧木材料对南方根结线虫的抗性表现可分为6种类型：免疫（I）：HS-2、BBS-1、BBS-2、BBS-4、BBS-5、BBS-7、BBS-9、BBS-10、BBS-11、BBS-12、BBS-15、BBS-16、BBS-17、19-4-3；高抗（HR）：HS-5、TH-1；抗（R）：HS-1、TH-18、TS-21、BBS-13、BBS-14；中抗（MR）：HS-4、HS-9、16-2-5；感（S）：HS-3、HS-10、13-5-2、16-2-7；高感（HS）：HS-12、HS-13、TH-5、TH-7、TH-11、TS-3、TS-4、17-2-1。免疫的占39%，高感的占22%，其余类型占比较少。

表1 不同品种或株系对南方根结线虫的抗性Table 1 Resistance of different varieties or strains to root-knot nematodes

3 讨论与结论

3.1 关于根结线虫的鉴定方法与分级标准

根结线虫的鉴定方法主要有形态学和分子生物学鉴定。形态学鉴定通常以根结线虫雌虫会阴花纹形态特征为依据[22]。本研究对采集的根结线虫进行了卵、2龄幼虫、雌虫及雌虫会阴花纹形态鉴定，且雌虫会阴花纹形态特征的鉴定结果与前人的鉴定结果相一致[21]，初步确定为南方根结线虫群体。由于根结线虫的形态特征受寄主与环境等多种因素的影响，仅依靠形态学鉴定可能会导致鉴定结果有误。分子生物学鉴定技术因具有高效性、精确性的特点，而被广泛应用于根结线虫的鉴定[23]。进一步的rDNA-ITS-PCR鉴定结果表明，本试验获取的根结线虫群体与已发表的南方根结线虫的ITS区编码序列同源性达98.83%，可确认属于南方根结线虫群体。

本研究发现，不同葡萄砧木株系或品种感染根结线虫病后，根系症状存在较大的差异，绝大多数株系受害后，根系形成念珠状的小根结，而对照‘夏黑’受害后，根系易形成大的根结瘤，这与不同葡萄品种感染根结线虫病后的表现症状差异较大的研究结果相一致[24]。

关于对南方根结线虫抗性鉴定的分级标准，目前主要有3种。一是根据根结数量划分抗性等级[13]，二是根据根的受害率划分抗性等级[25]；三是根据危害症状划分抗性等级[14]。此外，还有采用多项指标进行综合评价[26-27]。邵姗姗等[28]认为，根结的形成代表线虫的成功寄生，根结的发生程度可作为评价品种之间抗根结线虫病强弱的依据。本研究也发现，仅仅根据根结指数，结果不十分准确，但可初步判断葡萄材料对南方根结线虫抗性的强弱。如果以根系受害百分率来划分抗性等级，虽然也能在一定程度上反映植株整体根系的受害情况，但不能具体反映植株每条根系被危害的严重程度，仍较难区分抗性的强弱。采用综合评价标准体系，对亲缘关系较远的植株易受自身植物学特性的影响。因此，根据危害症状作为划分抗性等级或者计算病情指数的评价体系[14]，则比较适合。

此外，与田间自然鉴定法相比，人工接种鉴定可以克服自然条件的不利影响，如董炜博等人[29]发现在自然病田鉴定中入选的抗性资源，经进一步鉴定后许多被淘汰。因此，盆栽植株接种鉴定的结果更可靠，适宜于抗性品种的筛选。

3.2 关于葡萄种质资源对南方根结线虫的抗性

美洲野生葡萄资源中，抗根结线虫的种主要有河岸葡萄、沙地葡萄及香槟尼葡萄等[13,30]。翟衡等[13]将起源中国的14份野生资源划分为3类：抗南方根结线虫资源，包括华东葡萄、福建葡萄、毛葡萄、万县野葡萄和蛇葡萄属中的乌头叶葡萄；中度感病资源，包括大部分常见资源，如山葡萄、燕山葡萄、蘡薁葡萄、华北葡萄、刺葡萄及复叶葡萄；高度感病资源，包括小果野葡萄、葛藟和蛇葡萄属中的叶蛇葡萄。

葡萄砧木资源对南方根结线虫的抗性，根据前人的研究结果可分为4类[14,31-33]，即非常敏感：Vinifera（特别是白玉霓、Cot、品丽珠、Aramon Noir、Pinots Silvaner），1202C、AVG、143A、41B、333EM等；敏感：3309C、161-49C、196-17CL、216-3CL等；基本抗：3306C、101-14、Rupestris du Lot、Riparia Glorie、110R等；抗：Beanmont、775A、1103P、VR043-43、99R、140R、VR039-16、420A、SO4、5C、44-53M、1613C、5BB、贝达、狗脊、盐河、和谐、自由和无毛河岸葡萄等。

在葡萄栽培品种中，山欧杂种‘北红’‘北醇’‘北全’‘熊岳白’均不抗南方根结线虫[10]。欧美杂种‘巨峰’‘夏黑’‘阳光玫瑰’及欧亚种品种‘红地球’‘维多利亚’等全部为高感类型[10,14,24]。

生产上主要采用嫁接栽培的方法解决南方根结线虫的危害问题，因此选育抗南方根结线虫的砧木新品种具有重要意义。山葡萄是葡萄属中最抗寒的种[34]，前人鉴定认为山葡萄为中等感染南方根结线虫[13]，本研究选用中国野生山葡萄作为亲本之一，与起源于北美洲的抗根结线虫资源[14,16]河岸葡萄、沙地葡萄及砧木‘5BB’‘贝达’进行种间杂交，以期选育抗寒、抗南方根结线虫的砧木新品种。由于亲本的亲缘关系较远，植物学特性特别是对南方根结线虫的抗性不同[13-14,16]，有可能表现杂种优势。本研究中，5BB×山葡萄黑龙江实生组合后代的抗性都为免疫或抗，说明可能存在母性遗传。其它组合后代出现了抗性分离的现象，如河岸葡萄（♀）×山葡萄左山75097组合后代的抗性中既有免疫类型HS-2，也有高感类型HS-12和HS-13；山葡萄泰山-11×河岸-2组合、贝达×山葡萄左山75097组合后代的抗性也有类似的分离现象，说明种间杂交是创造抗南方根结线虫新种质的重要途径。因此，下一步将对筛选的抗性优株进行嫁接试验，以期选育出抗南方根结线虫特别是多抗性砧木新品种。

3.3 结论

供试的36个砧木杂种优株对抗南方根结线虫的抗性表现免疫14个株系，高抗2个株系，抗5个株系，中等3个株系，感4个株系，高感8个株系。其中组合5BB×山葡萄黑龙江实生后代中抗性更偏向于免疫或高抗，免疫的比例为86%，抗的比例为14%。筛选获得的抗南方根结线虫类型为进一步选育多抗性葡萄砧木新品种奠定了材料基础。