朱永玺,马永钧

(西北师范大学化学化工学院，甘肃 兰州 730070)

香兰素(Vanillin，Va)是天然香草植物含有的一种天然芳香物质，香兰素因其特殊的芳香特性被广泛使用，它主要以芳香添加剂方式应用于香水、饮料、烟草等[1]。目前大部分香兰素纯品来源于通过化学合成的方式，当食品及饮品中香兰素添加量超标时，也会对人体造成危害。根据联合国粮食及农业组织的标准，香兰素每日摄入量应低于10 mg/kg。因此，基于食品安全考虑就有必要检测各种食品中的香兰素含量，而开发一种高灵敏、低成本香兰素电分析检测方法亦有必要。

目前，可用于准确测定各种食品样品中香兰素的分析方法主要有分光光度法[4]、气相色谱法、毛细管电泳法[7]、化学发光法[8]，和高效液相色谱法等[9]。然而，上述检测方法的成本较高，尤其对样品的预处理过程非常复杂。近年来，由于香兰素分子中具有电活性基团，故可利用电化学传感器对香兰素进行电分析检测[10]，而电分析方法具有灵敏度高、选择性好、廉价且快速等优势，也已被应用于实际样品中香兰素的定量检测[3]。但是实验发现香兰素在裸玻璃碳电极上的过电位较高，还易在电催化氧化过程中发生自聚合现象导致电极被污染。人们尝试通过对电极表面改性修饰，能部分降低工作电极的毒化。如Huang等[12]制备了银纳米颗粒/石墨烯/玻碳电极(Ag/NPs/GN/GC)，由于Ag/NPs/GN具有大的比表面积和良好的导电性，对香兰素表现出良好的电催化氧化能力和电极耐用性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电化学工作站(CHI 760B)，上海辰华仪器公司；电化学实验采用三电极测试体系，以直径为3 mm玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl (0.1 mol/L KCl)为参比电极。

谷氨酰胺(含量≥99%)，阿拉丁试剂；高胱氨酸(含量≥98%)，阿拉丁试剂；纳米氧化铒(含量≥99.9%)，北京德克岛金；铁氰化钾(A.R，经重结晶纯化)；2,4,6-三氨基嘧啶(含量≥98%)，阿拉丁试剂；香兰素 (含量≥ 99%)，百灵威试剂有限公司；其余试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1 mmol/L 香兰素标准溶液配制：称取香兰素固体粉末，用二次蒸馏水加热溶解。

复合修饰电极制备过程：按参考文献先以氨基重氮化反应液对玻碳电极基底进行接枝修饰[13]，具体操作是将裸GCE置于含谷氨酰胺(2.50 μmol/L)、NH4Cl(0.12 mol/L)、HCl(0.10 mol/L)、NaNO2(0.50 μmol/L)、0.056%曲通的电解液中，采用循环伏安法(CV)在 -1.2～2.15 V区间内扫描2段，成功通过C-C键将谷氨酰胺键合在GCE表面。再参考文献[14]将稀土离子置换为铒离子，有机配体置换为2,4,6-三氨基嘧啶配制电镀液，将上述电极置于此电镀液中，在电位区间 -0.25～0.6 V，扫速17 mV/s的条件下，CV扫描10圈。然后将电极置于0.2 mol/L氯乙酸缓冲溶液中，CV扫描6段，清洗电极。最后将上述修饰电极置于含高胱氨酸(1.25 μmol/L)、PBS(0.15 mol/L，pH=6.0)和Na2SO4(0.10 mol/L)的电解液中，再采用CV在 -1.15～2.40 V区间内扫描4段，最后将该电极置于0.20 mol/L 氯乙酸缓冲溶液中，在电位区间0.00～1.20 V、扫速100 mV/s的条件下，扫描6段，以清除电极表面残留氨基酸，用蒸馏水淋洗干净备用。

1.3 实验步骤

在10 mL比色管中，加入优化组成的支撑电解质溶液及一定量的香兰素标准溶液，用二次蒸馏水定容，充分摇匀后转移至电解池。采用三电极体系，在搅拌条件下，用示差脉冲伏安法(DPV)，在0.35 V预电解10 s，停止搅拌后静置5 s，进行电化学实验并在0.35～0.75 V电位区间记录伏安图。电化学仪器参数设置：脉冲宽度(60 ms)，脉冲高度(100 mV)，脉冲间隔时间(200 ms)。

2 结果与讨论

2.1 香兰素在不同修饰电极上的电催化氧化伏安响应曲线

利用示差脉冲伏安法(DPV)，对20 μmol/L香兰素标准溶液在裸玻碳电极和修饰电极上的电催化行为进行研究。香兰素在裸电极(图1a)上的氧化峰峰形较宽，电流响应信号较弱，而在复合修饰电极(图1b)上的氧化峰峰形对称，且峰电流明显增加。修饰电极相比裸玻璃碳电极，香兰素的电催化氧化反应的伏安峰明显增大，也说明该复合修饰层有协同电催化活性。

图1 香兰素在不同工作电极上的示差脉冲伏安图Fig.1 Differential pulse voltammograms of vanillin at the different working electrodes

2.2 支持电解质的优化及电极上香兰素的传质行为

以复合修饰电极为工作电极，用20 μmol/L香兰素标准溶液为测试样，对电解质的组成进行实验优化。证明选择PBS缓冲溶液为支持电解质比较好，并对PBS浓度和pH值进行分别进行优化，当PBS浓度为0.15 mol/L，pH值为5.5时，香兰素在复合修饰电极上的电催化峰电流最大，此优化值与文献相符[15]。我们又用CV法对香兰素主氧化峰的电流值(Ip)与扫速(v)之间的关系进行研究。实验发现：当扫速在0.01～0.10 V/s的范围内时，香兰素的氧化峰电流值与扫速呈现正比关系，线性方程为：Ip(μA)=0.4078+33.23v(V/s) (R2=0.9986)，说明香兰素在该复合化学修饰电极上的电催化氧化过程为表面吸附传质控制。

2.3 预电解电位和预电解时间的优化

如图2A所示，在修饰电极上，香兰素的电催化氧化反应的伏安行为受测试仪器预设条件的影响比较大。对比曲线a，b发现，不加预电解条件时，香兰素的主氧化峰位于0.55 V处，但在0.47 V处会产生一个明显的吸附氧化前波；但在设置了预电解条件后测定时，其主氧化峰的电位值没有移动而峰电流却有增加，并且0.47 V处的吸附氧化前波能完全消失，这说明若采用预电解伏安法进行测量香兰素最为适宜。同时，通过实验可得到两个预电解参数的优化曲线，如图2B所示，预电解电位为0.35 V(a)，预电解时间25 s时(b)，香兰素氧化前波消失，电流响应信号最佳。

图2 施加预电解措施前后香兰素的DPV伏安曲线对比图(A)及预电解电位和预电解时间的优化曲线(B)Fig.2 Comparison DPV curves of vanillin with or without the preconditions of pre-galvanolysis parameters (A) and optimization curve of both pre-galvanolysis potential and time (B)

已知香兰素分子中同时具有苯甲醛基和酚羟基两个电活性位点，再参考文献可知，香兰素的主氧化峰主要来源于分子中酚羟基电氧化为邻醌基团的过程。考虑到优化的预电解电位正好位于0.47 V左右的实验事实。由此我们推测，香兰素的氧化前波可能主要来源于香兰素分子中苯甲醛基氧化为羧基基团的过程。因此，按照图3的推测机理，复合化学修饰电极表面的电催化氧化机理为：在预电解条件下醛基先被氧化为羧基，然后含羧基的中间体的酚羟基和相邻的甲氧基再被氧化为含邻醌基团的最终产物。

图3 设置预电解条件下香兰素可能的电催化氧化反应机理Fig.3 Possible electrocatalytic oxidation mechanism of vanillin pre-galvanolysis under the preconditions of pre-galvanolysis parameters

在设置的预电解实验条件下，研究了支持电解质的pH对香兰素主氧化峰峰电位的影响，发现香兰素氧化峰电位随pH值增大而向负电位移动，线性方程为：Ep(V)=0.7987-0.04577pH，R2=0.9948，该曲线斜率与标准温度下的-2e-/1H+体系的能斯特方程斜率(0.0296)比较接近，故判断香兰素的主氧化峰涉及2电子和1质子参与反应，这个判断也与图3的推测机理完全相符。

2.4 定量测定香兰素的工作曲线

图4 不同浓度香兰素标准溶液的示差脉冲 伏安曲线和其测定标准曲线Fig.4 DPV curves of vanillin standard solutions at the different concentration level and the calibration cure for quantitative analysis of vanillin

2.5 复合化学修饰电极的选择性和稳定性

以含20 μmol/L的香兰素标准溶液为试样，添加一定量干扰物质，观察其对香兰素氧化峰电流值的影响。实验发现：以香兰素氧化峰电流值变化的相对误差在±5%内为限度，加入100倍NaCl、KCl、柠檬酸钠，80倍维生素C，50倍葡萄糖、甜蜜素等对香兰素的氧化峰电流值的影响甚小。故该复合修饰电极对香兰素的电催化氧化具有良好的选择性。对同一支复合修饰电极重复扫描10次，香兰素氧化峰电流值大小变化的相对误差不超过±5%，说明此复合修饰电极具有良好的稳定性。

3 结 论