吴思佳，谢星光，杨 阳，郑承剑，韩 婷 （海军军医大学药学院, 上海 200433）

植物内生真菌与宿主植物共生，可调节植物应对多种生物和非生物胁迫，促进植物产次生代谢产物[1-4]。除了对自身宿主植物的有益影响，当前已有许多研究表明内生真菌对非宿主植物同样具有重要的生态功能，如分离自短芒大麦草、麦草、醉马草的内生真菌asexualEpichloëgansuensis可显著改善老芒麦种子萌发并促进其生长[5]；分离自沙漠植物的印度梨形孢（Piriformaspore indica）可促进药用植物丁香罗勒生长并减少叶和茎中熊果酸和齐墩果酸的积累[6]；分离自重阳木的内生真菌拟茎点霉（Phomopsis sp.）可加快药用植物苍术凋落物木质素的降解，有助于减小连作障碍效应[7]。这些现象为内生菌资源的新生态功能研究，及其对非宿主药用植物的活性成分的研究提供了新的思路，促使越来越多国内外的学者在这一领域开展相关研究。

中药丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza的干燥根和根茎[8]，是一种被广泛应用于心脑血管疾病治疗的重要中药材[9]。现代药理学研究表明，丹参的主要活性成分为脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的丹参酚酸类化合物[10]。本课题组前期获得一种可促进模式植物拟南芥生长的内生真菌Epichloë bromicolaSH09。E. bromicola是一种与冷季型牧草长期、永久共存的内生真菌，可导致禾草香柱病[11-13]，其对双子叶药用植物的生长和代谢是否有影响尚不明确。因此，本文主要探究内生真菌E. bromicolaSH09 是否可以促进模式药用植物丹参生长，增加其活性成分的积累，研究成果有助于理解内生真菌对非宿主植物产生的生态功能，并有助于丹参生物菌肥的栽培应用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌肥

内生真菌E. bromicolaSH09 由本课题组保存。使用马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）活化E.bromicolaSH09 菌株，温度为（28± 1）℃。4 周后，在PDA 平板上使用打孔器打孔，将E. bromicolaSH09 菌块转移至马铃薯葡萄糖培养基（PDB）进行扩大培养，条件为25 ℃，140 r/min。本研究所用的固体发酵培养基由250 g 麦麸，250 g 棉籽壳，20 g葡萄糖，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4.7H2O，加1 L 去离子水组成，经121 ℃，30 min 高压灭菌后备用。接着将培养7 d 的E. bromicolaSH09 培养液倒入含40 g 固体培养基中（容器为250 ml 培养瓶，图1 C），用接种针混匀后划成1 cm×1 cm 方块，25℃条件下培养3 周，得到表面长满菌丝的E. bromicolaSH09 固体菌肥（图1A 菌株正面，图1B 菌株背面）。

图1 E. bromicola SH09 菌株和固体发酵菌肥

1.1.2 供试丹参

丹参种子来源于陕西省商洛市天士力丹参种植基地，经浙江中医药大学药学院院长秦路平教授鉴定。

1.1.3 标准品

二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、迷迭香酸、丹酚酸B 均购自成都曼思特生物科技有限公司，甲醇、乙腈为色谱纯。

1.2 E. bromicola 固体菌肥与丹参共培养

将丹参种子播种至润湿的混合栽培基质（腐殖土：蛭石=1：1）中，于22～ 24 ℃，16/8 h 光照周期条件培养1 个月。选取长势相近的丹参苗，继续培养20 d。选取15 株5 cm 左右高的丹参苗，随机分成3 组，分别为对照组、菌肥处理60 d 组、菌肥处理120 d 组，每组5 株，菌肥处理组于根部均匀撒20 gE. bromicolaSH09 固体菌肥，对照组于根部均匀撒20 g 不含菌的固体菌种培养基。隔天浇水。

共培养至第60 天和第120 天分别收获丹参苗，测定植株的分蘖数、株高（以分蘖的长度作为株高）、叶数、叶面积作为形态指标；冲洗丹参根，拭去表面的水，称量鲜重；将新鲜的丹参根置于50 ℃烘箱干燥1 周，称量干重；研磨干燥的丹参根，过40 目筛，用于测定丹参酮和丹参酚酸含量。

1.3 丹参酮和丹参酚酸的HPLC 分析方法

精密称取0.20 g 丹参根粉末，加入4 ml 甲醇浸泡过夜，500 W 超声提取45 min，再用0.45 μm微孔滤膜过滤备用。利用Agilent -1 200 自动进样色谱仪，Agilent ZORBAX SB - C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱进行丹参酮和丹参酚酸的含量测定。色谱条件：流速为0.8 ml /min ；柱温为30 ℃；进样量为20 μl；检测波长为280 nm；流动相为乙腈(A)-0.05%甲酸水(B)；梯度洗脱：0～20 min，20 %～40 %A；20～21 min，40%～80% A；21～40 min，80%～90% A；40～45 min，90%～20% A。分别进行重现性试验、精密度试验、稳定性试验、加样回收率试验，以验证分析方法的可行性。

1.4 数据处理

2 结果

2.1 E. bromicola 对丹参生长的影响

通过丹参苗的4 个形态指标和丹参根的鲜重、干重2 个指标，评价内生真菌E. bromicolaSH09对丹参生长的影响。由图2 可知，E. bromicolaSH09与丹参共培养60 d 和120 d 后，共培养组丹参苗的分蘖数（图2C）、株高（图2D）、叶片数（图2E）、叶面积（图2F）与对照组相比均显著增加。其中分蘖数在共培养60 d 和120 d 后分别是对照组的1.48和2.29 倍；株高分别是对照组的1.33 倍和1.48 倍；叶片数分别是对照组的1.33 倍和2.37 倍；叶面积分别是对照组的2.00 倍和2.32 倍。

图2 E. bromicola 对丹参苗生长的影响

由图3 可得，E. bromicolaSH09 与丹参共培养60 d 和120 d 后，丹参根的生物量与对照组相比显著提高。其中，丹参根的鲜重在共培养60 d 和120 d后分别是对照组的2.11 和2.16 倍（图3A）；干重分别是对照组的3.06 倍和2.73 倍（图3B）。上述结果均表明内生真菌E. bromicolaSH09 可促进丹参苗的生长。

图3 E. bromicola 对丹参苗生物量的影响

2.2 E. bromicola 对丹参活性成分积累的影响

测定丹参干燥根中4 种丹参酮类成分和2 种丹参酚酸类成分的含量，以探究E. bromicolaSH09对丹参活性成分积累的作用。由图4、图5 可知，E. bromicolaSH09 与丹参苗共培养60 d 和120 d可显著促进丹参根中4 种丹参酮类成分和2 种丹参酚酸类成分的积累。对于丹参酮类成分，在共培养60 d 和120 d 后，共培养组隐丹参酮含量分别是对照组的5.77 倍和2.63 倍（图4A）；二氢丹参酮I含量在共培养60 d 后是对照组的2.57 倍，在共培养120 d 后无显著差异（图4B）；丹参酮I 含量分别是对照组的2.49 倍和2.29 倍（图4C）；丹参酮IIA含量分别是对照组的3.44 倍和2.13 倍（图4D）。对于丹参酚酸类成分，在共培养60 d 和120 d 后，共培养组丹酚酸B 含量分别是对照组的 1.76 倍和1.32 倍（图5A）；迷迭香酸含量在共培养60 d 后是对照组的1.32 倍，而共培养120 d 后与对照组无显著差异（图5B）。综上可得，E. bromicolaSH09 可促进丹参根中丹参酮类和丹参酚酸类成分的积累。

图4 E. bromicola 对丹参根中丹参酮类成分的影响

图5 E. bromicola 对丹参根中丹参酚酸类成分的影响

3 讨论

由于丹参对心脑血管疾病有显著疗效，丹参相关制剂在全球范围有较高需求量。然而现产丹参多为栽培种，不同产区品质参差不齐，且生长周期长达2 年，因此我们亟需对其传统培育技术进行改良，以得到高产、稳产的优质丹参[14-15]。植物内生真菌普遍存在于植物健康组织中[4]，已有研究表明，内生真菌可以通过促进药用植物的生长发育和次生代谢产物积累，从而提高药用植物品质[16-18]。本研究探究了内生真菌E. bromicolaSH09 对丹参生长及其活性成分丹参酮和丹参酚酸积累的影响。

研究结果显示，E. bromicolaSH09 与丹参苗共生2 个月和4 个月后，分蘖数、株高、叶片数、叶面积以及鲜重、干重均较对照组显著提高，且分蘖数、株高、叶片数、叶面积、鲜重的促进程度（与对照组相比）均随着培养的时间延长而增加。已有研究表明内生真菌深绿木霉D16 菌肥可有效促进药用植物丹参的生长及其活性成分丹参酮的积累[3]，5、15、25 g D16 菌肥分别培养丹参4 个月后，3 种浓度的菌肥对丹参干重的促进程度均不及本研究E. bromicolaSH09 对丹参干重的促进程度。但D16 菌肥培养丹参6～8 个月时，丹参苗快速生长，15 g D16 培养丹参8 个月后，其干重高达对照组的5.61 倍。E. bromicolaSH09 与丹参苗共生2 个月和4 个月后，丹参酮（隐丹参酮、二氢丹参酮I、丹参酮I、丹参酮IIA）和丹参酚酸（丹酚酸B、迷迭香酸）含量均被显著增加，其中隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA 和丹酚酸B 的积累被持续促进。D16与丹参共培养后和E. bromicolaSH09 有类似作用，且该作用在共培养6 个月后达到峰值。丹参是多年生植物，故E. bromicolaSH09 在4 个月后如何影响丹参的生长和活性成分积累有待进一步研究。目前，内生真菌对非宿主药用植物的作用研究仍不够深入。内生真菌可能通过促光合作用促进药用植物生长，通过介导植物体内信号分子、酶基因、植物激素等调节药用植物次生代谢，从而提高药用植物的品质。有研究表明，毛竹的3 种内生菌均可提高叶绿素含量，促进光合作用，以促进毛竹生长[19]；地黄内生真菌GG22 通过诱导茉莉酸合成关键基因的表达上调地黄中茉莉酸类物质[20]；丹参内生真菌U104 通过上调丹参酮生物合成途径的关键酶基因促进丹参酮的积累[21]；转录组和蛋白质组学共同揭示了丹参内生真菌制备的诱导子通过调节钙离子、氧化应激、乙烯、茉莉酸、水杨酸等信号转导过程影响丹参酮和丹参酚酸的代谢[22]；并有研究推测药用植物龙胆的3 种木霉属内生菌通过改变龙胆中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物的酶活性提高植物抗病性[23]。然而，E. bromicolaSH09 具体通过怎样的途径促进丹参生长和活性成分积累，也有待更深层的研究。