余祖玲， 余祖华， 贾艳艳， 廖成水， 李 旺， 李元晓， 何万领， 丁 轲,

(1.河南科技大学 功能微生物与精准营养实验室，河南 洛阳 471023; 2. 洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室， 河南 洛阳 471023)

0 引言

纤维素酶是一类可以使纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的酶系的总称，包括羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。动物饲料中含有大量的纤维素，但除反刍动物外，其他动物很少分泌纤维素酶消化分解纤维素[1]。因此，筛选具有纤维素酶活的菌株，并将其用于单胃动物生产，能够促进单胃动物对饲料中纤维素的利用率，也能够提高饲料中纤维素的添加量，从而提高经济效益[2]。自1912 年首次从土壤中分离出可降解纤维素的微生物[3]以来，陆续有学者分离鉴定出能降解纤维素的微生物，包括真菌、细菌以及原生动物[4-5]等。文献[6]分离的暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)H-7 羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose, CMC)酶活和滤纸酶活(filter paper activity, FPA)最高分别可达0.18 U/mL 和0.44 U/mL。文献[7]筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilies)Lu14的CMC酶活为1.106 U/mL， FPA酶活为0.76 U/mL。但由于产酶量较低等原因，无法满足工业生产的需求。因此，在自然界中筛选纤维素降解能力强的菌株仍然是一件必要且有意义的工作。文献[8]报道过产酶菌株,凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)便是其中之一。凝结芽孢杆菌进入肠道可以分泌多种有益物质,如α-半乳糖苷酶、蛋白酶、木聚糖酶等[9],还可以通过发酵产乳酸，具有耗能少、产率高、经济效益高等优点[10],可以替代抗生素调控机体肠道菌群生态平衡，抑制肠道有害菌群，提高消化吸收能力,从而提高动物机体免疫力和生产性能[11]。凝结芽孢杆菌属嗜热菌,生存弹性优良，可在较高温度环境下发酵[12]，较适合生产需要，因此受到广泛关注。美国饲料管理协会与中国农业部相继将凝结芽孢杆菌列为养殖生产中可直接饲喂的微生物制剂[13]，同时也将凝结芽孢杆菌作为新资源食品公示[14]。早在2005 年，中国食品和药品监督管理局授予了青岛东海药业有限公司凝结芽孢杆菌活菌片的新药证书[15]。本文主要根据益生菌的生物学特性，以从土壤中分离出来的芽孢杆菌为研究对象，将其降解纤维素能力及耐酸耐高温能力作为主要评价指标，辅以对人工胃液、胆盐胁迫的耐受性以及耐药能力进行综合评价，以期为芽孢杆菌的新型饲料微生态制剂产品的开发提供研发素材。

1 材料与方法

1.1 材料

样品：采集于河南科技大学玉米试验田及红叶李树林根际的深度2～5 cm的不同位置土壤样品。

分离培养基(1 L)：硫酸亚铁0.01 g，磷酸氢二钾0.4 g，氯化钾0.5 g，硝酸钠3 g，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10 g，七水硫酸镁0.5 g，121 ℃高压灭菌25 min。

增菌培养基(1 L)：氯化钠5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，马铃薯浸出粉5 g，葡萄糖15 g，氯化钠5 g，115 ℃高压灭菌20 min，加入用无水乙醇溶解的0.02%(质量分数)的硫酸链霉素。

发酵产酶培养基(1 L)：硫酸铵2 g，磷酸二氢钾4 g，羧甲基纤维素钠10 g，蛋白胨3 g，七水硫酸镁0.3 g，酵母膏0.2 g，121 ℃高压灭菌25 min。

滤纸培养基(1 L)：定性滤纸(长6 cm、宽1 cm)3条/锥形瓶，硫酸铵1 g，七水硫酸镁0.5 g，磷酸氢二钾1 g，酵母浸粉0.1 g，121 ℃高压灭菌25 min。

MRS(de Man,Rogosa,Sharpe)培养基(1 L)：葡萄糖20 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，牛肉膏10 g，四水硫酸锰0.25 g，七水硫酸镁0.58 g，Tween-80 1 mL，磷酸氢二钾2.6 g，乙酸钠5 g，柠檬酸铵2 g。

固体培养基：在液体培养基的基础上添加质量分数为1.2%～1.5%的琼脂粉。

主要试剂为模拟胃液(1 L)：胰蛋白胨8.3 g，葡萄糖3.5 g，氯化钠2.05 g，氯化钙20.11 g，氯化钾0.37 g，磷酸二氢钾0.6 g，猪胆盐 0.05 g，溶菌酶 0.1 g，胃蛋白酶13.3 g，用盐酸分别调pH值至1.5和2.5。

其他试剂：0.5%(质量分数)刚果红染液、 1 mol/L NaCl洗脱液、 0.1 mol/L-pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液、3，5-二硝基水杨酸、 1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，现配现用。

微量生化发酵管：葡萄糖、蔗糖等36种发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司。

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂：Taq酶(5 U/μL)、DL2000、Goodview核酸染料、琼脂糖凝胶，购自北京方宝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离筛选

将采集的土壤样品进行编号，分别称取5 g样品与100 mL生理盐水混匀，37 ℃、200 r/min振摇1 h。然后，各取 1 mL上述处理组，用生理盐水进行10倍稀释，每个稀释梯度取 100 μL菌液涂布于分离培养基中，挑选生长良好的菌株转接至增菌液体培养基中培养，37 ℃培养24 h，离心取沉淀与100 μL生理盐水于1.5 mL试管中吹吸混匀，然后吸取10 μL转接于分离培养基中， 37 ℃培养2～3 d。取出后，滴加5 mL、0.5%(质量分数)的刚果红染液染色，用1 mol/L的氯化钠溶液脱色，最后根据有无水解圈，初步得到纤维素降解菌，通过油镜观察菌株的显微形态，将符合芽孢杆菌的菌株进行传代纯化并保存。

1.2.2 滤纸降解测定

观察并记录菌落周围的透明圈直径(H)与菌落直径(C)比值的大小。将H/C值较大的菌株接种到增菌液体培养基中，于37 ℃摇床培养制备菌悬液。将菌悬液分别以2%(体积分数)的接种量接种到100 mL滤纸条培养基中，37 ℃培养，并观察滤纸条崩解情况，每个菌株设3个技术重复。根据滤纸崩解情况对菌株纤维素降解能力进行判断。“++++”表示滤纸呈半清状；“+++”表示滤纸呈糊状；“++”表示滤纸呈不定状；“+”表示滤纸边缘已膨胀[12]。

1.2.3 纤维酶活力测定

采用3，5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活(CMC)和滤纸酶活(FPA)，调整菌株浓度的OD540为0.5，然后以1∶100的比例接种到产酶培养基上制备粗酶液，在50 ℃水浴反应条件下，室温测量计算产糖量。1 min水解底物产生1 mg葡萄糖所需酶量，单位为U/mL。

计算公式：酶活(U/mL)=(P×V1)/(V2×T)，

其中：P为葡萄糖质量浓度，mg/mL；V1为测定总体积，mL；V2为样品酶液体积，mL；T为反应时间，min。

1.2.4 菌株鉴定

生理生化鉴定。参照《伯杰细菌鉴定手册》[16]和《常见细菌系统鉴定手册》进行，包括运动性、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等，以及甘露醇、明胶液化、甲基红试验、V-P试验、吲哚试验、淀粉分解、5% NaCl试验等。

16S 核糖体脱氧核糖核酸(ribosomal deoxyribonucleis acid,rDNA)的测定及系统发育树的构建。取1.5 mL灭过菌的离心管加入500 μL生理盐水，挑取单菌落于离心管中混匀，100 ℃以上沸水浴15 min，随即置于冰盒5 min降温，使细胞壁破裂释放全部基因组。12 000 r/min离心2 min，吸取上清液，即目的DNA。扩增16S rDNA，所用引物为细菌通用引物。16S rDNA反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s；54 ℃ 45 s；72 ℃ 2 min；30个循环，72 ℃ 10 min延伸，4 ℃保温。扩增完成后，用1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳对 PCR产物进行检测，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察到约1 450 bp处出现明亮条带，与预期结果一致。将 PCR 产物送至上海生物工程有限公司进行测序。将所测得的序列在Genbank数据库进行 BLAST分析，获得相似性≥98%的16S序列，利用BLAST软件进行比对，通过Mega7.0软件构建系统树，以16S rDNA基因序列同源性A>98%为鉴定标准。

1.2.5 耐胆盐试验

将过夜培养的菌液按6%的接种量分别接种于胆盐质量分数为0%、1%、2%、3%、4%的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养12 h。取样0.2 mL，在装有1.8 mL 0.1%的琼脂生理盐水的试管中倍比稀释，选择适宜稀释浓度的稀释液20 μL点样于MRS培养基，每个浓度设3个重复。37 ℃培养10 h，培养结束后对平板上的菌落进行计数，取3组重复组的菌落数平均值进行分析，计算存活率。

1.2.6 耐酸试验

将过夜培养的菌液吸取1 mL于1.5 mL灭过菌的离心管中，5 000 r/min 条件下离心 10 min，所得菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，再重新接种于无菌生理盐水(调pH 值分别为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0)中，于 37 ℃摇床培养 4 h。然后，取 0.2 mL 培养液稀释于 1.8 mL 0.1%的琼脂生理盐水中，进行梯度稀释，取适宜浓度的稀释液20 μL点样于MRS培养基上，每个稀释度做3个重复，在 37 ℃静置培养 12 h，取3组重复组的菌落数平均值进行分析，计算存活率。

1.2.7 耐胃液试验

取稀盐酸1 moL/mL，加水稀释，调节pH至1.5，每100 mL加入1 g胃蛋白酶，将溶液混匀后过滤备用。将过夜培养的菌液按6%的接种量置于离心管中离心去上清后转接到模拟胃液中，分别在0 min、60 min、180 min后取0.2 mL，与1.8 mL 0.1%的琼脂生理盐水倍比稀释，取适宜浓度20 μL在MRS培养基上点样培养，每个稀释度设3个重复，37 ℃静置培养12 h后取出，取3组重复组的菌落数平均值进行分析，计算存活率。

1.2.8 耐高温试验

准备灭过菌的试管分别进行编号，将过夜培养菌液按6%的接种量接种到试管中，设置水浴锅温度为100 ℃，设时间梯度为0 min、3 min、6 min、9 min、12 min、15 min，每个时间梯度都设3个重复，在不同的时间梯度，将相对应的试管取出，取0.2 mL与1.8 mL 0.1%的琼脂生理盐水混匀，取20 μL点样在MRS培养基上，设3个重复试验，37 ℃静置培养12 h后，取3组重复组的菌落数平均值进行分析，计算存活率。

1.2.9 药敏试验

菌种活化后，用灭菌的生理盐水将菌液稀释为 1.0× 108cfu/mL的菌悬液，然后吸取 100 μL涂布于MRS平板上，待表面稍干后，放入抗生素药敏片，每种抗生素药敏片都做 3 个重复。37 ℃培养 24 h，观察平板上药物的抗菌活性，记录各抗生素的抑菌圈直径大小。试验重复3次，取平均值，按照抑菌圈直径标准进行菌株的药敏性评定。

1.2.10 数据统计与分析

存活率=(试验组活菌数/对照组活菌数)×100%。

数据采用SPSS22.0进行统计学分析，数据结果以“均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛结果

将处理后的样品稀释适当浓度后涂布于分离培养基，分离出生长良好的菌株共32株，用刚果红染色观察发现共有7株菌产生酶解圈，通过计算水解圈直径和菌落直径的比值(H/C)来初步判定降解纤维素能力较强的菌株，结果如表1所示。

表1 分离菌株的H/C结果

2.2 菌株滤纸酶活结果

纤维素降解菌株的滤纸条崩解试验结果见表2。由表2可知：菌株MRS-913将滤纸条崩解为不完全的糊状，培养至第5天时，已经完全崩解为糊状，菌株MRS-19和MRS-04在培养至第6天时，滤纸条崩解为不完全的糊状，其余菌株崩解效果较差，只能崩解滤纸边缘。将7株菌株与对照组相比，菌株MRS-913崩解效果较为突出。

2.3 菌株纤维素酶活测定结果

将滤纸崩解试验得到的7株菌株接种到产酶发酵培养基中培养3～4 d，制备粗酶液并测定其纤维素酶的活性，筛选出3株产酶活性较强的菌株，测定结果见表3。由表3可知：MRS-913的CMC和FPA均最好，挑选其做进一步的鉴定。

表2 菌株滤纸条崩解情况

表3 纤维素酶活测定结果 U/mL

图1 菌株MRS-913显微形态图(1 000×)

2.4 菌株MRS-913鉴定结果

2.4.1 形态学鉴定结果

菌株MRS-913在分离培养基上生长良好，菌落为灰偏白色、圆形，表面湿润有光泽，边缘整齐，中心突起。显微镜下观察可见菌体呈紫色链长杆状，端生芽孢，无鞭毛且芽孢囊没有明显膨大(见图1)。

2.4.2 生理生化鉴定结果

菌株MRS-913生理生化试验结果如表4所示，菌株MRS-913接触酶、过氧化氢酶、淀粉酶阳性；V-P试验反应阴性为兼性厌氧菌；吲哚试验呈阴性；7%氯化钠生长阳性；明胶液化阴性。将上述鉴定结果与《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行对照，结果发现该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

表4 菌株MRS-913生理生化鉴定结果

2.4.3 16S rDNA鉴定结果

菌株MRS-913经16S rDNA测序后，登录Genbank，登录号为MZ642313。利用MEGA7.0软件与芽孢杆菌属内相关种进行同源性比对，16S rDNA序列同源性在95%以下可以认为属于不同属；同源性为95%～98%可以认为是同属不同种；同源性大于99%则认为属于同一种。如图2所示，经BLSAT同源性比较，MRS-913菌与凝结芽孢杆菌的亲缘关系最近，同源性为99.93%，所以此菌株应归属于凝结芽孢杆菌。

2.4.4 耐胆盐试验结果

凝结芽孢杆菌MRS-913耐胆盐试验结果如图3所示，由图3可知：凝结芽孢杆菌MRS-913在胆盐质量分数为0%～4%时，随着胆盐质量分数的增加，菌株的存活率降低。培养了10 h后，在胆盐质量分数高达4%的培养基中菌株存活率依然有32.8%，可见凝结芽孢杆菌MRS-913对胆盐有着较强的耐受力。

2.4.5 耐酸试验结果

凝结芽孢杆菌MRS-913耐酸试验结果如图4所示。由图4可知：随着pH值的降低，菌株的存活率降低。在培养4 h后，当pH值为1时，菌株的存活率为55.9%。与pH值为7时菌株的存活率对照，发现当pH值为5时，菌株存活率高达93.4%。由此可见，凝结芽孢杆菌MRS-913对酸有较强的耐受力。

图2 菌株MRS-913基于16S rDNA序列系统进化树

图3 凝结芽孢杆菌MRS-913耐胆盐试验结果

2.4.6 耐胃液试验结果

通常动物体胃酸pH为1.5～3.0，食物在胃中停留时间为1～2 h。本试验设计了两组pH，每组设置了3个时间点，探究凝结芽孢杆菌MRS-913的胃液耐受力，结果如图5所示。由图5可以看出：凝结芽孢杆菌MRS-913在pH为1.5的模拟胃液中能够存活180 min，存活率为62.7%。在pH为2.5的模拟胃液环境中能够存活180 min，存活率达74.8%。由此可见，凝结芽孢杆菌MRS-913的芽孢耐受胃酸的能力很强。

2.4.7 耐高温试验结果

耐高温属性赋予了凝结芽孢杆菌食品加工全新定义的功能，结合现有文献，设计本试验。凝结芽孢杆菌MRS-913的高温耐受结果如图6所示，将温度设置为100 ℃，同时在0～15 min设置了6个时间点。在100 ℃水浴15 min后，凝结芽胞杆菌MRS-913的存活率为54.0%，说明其对高温有着较强的耐受力。

2.4.8 耐药试验结果

判断菌株的益生特性，还需要测试其对抗生素的敏感性。凝结芽胞杆菌MRS-913的药物敏感性试验结果如表5所示。由表5可知：除对杆菌肽、奥普托欣、林可霉素不敏感；对阿奇霉素低敏；对多黏菌素B、链霉素中度敏感；对红霉素、卡那霉素高敏外，对其他7种抗生素都极高敏。

3 讨论

本研究通过采集土壤样品进行筛选，最终筛选出了一株纤维素酶活性较高的菌株MRS-913，其酶活力可达(59.68±1.43) U/mL，降解纤维素能力较强。探究了凝结芽孢杆菌MRS-913的耐人工胃液、耐胆盐、耐高温、耐酸以及抗生素的敏感性能。发现凝结芽孢杆菌MRS-913对于胃液的耐受能力较强，在pH2.5的胃液环境中能够存活180 min，存活率高达74.8%，高于文献[17]分离的凝结芽孢杆菌N1在模拟胃液处理120 min后的存活率。文献[18]研究发现，凝结芽孢杆菌13002在0.3%(质量分数)的胆盐试验中，作用24 h的活菌总数出现反弹，存活率不降反升，达到81.4%，该试验结果可推测出凝结芽孢杆菌可以在肠道存活并且有极大可能增殖。文献[19]研究证实凝结芽孢杆菌最高可耐受3.0%(质量分数)胆盐，本研究发现凝结芽孢杆菌MRS-913最高可耐受4%(质量分数)的胆盐，在培养了10 h之后存活率依然有32.8%。由此可见，小肠的胆盐环境对此菌株没有抑制作用。高温在实际生产中严重影响益生菌活性，文献[17]在凝结芽孢杆菌13002耐高温试验中，仅探究了最高温度80 ℃下的耐受性能，且认为在60 ℃时的耐受性能最高。与文献[20]发现凝结芽孢杆菌NJh032在100 ℃处理10 min后存活率65.35%的结果相较，MRS-913在100 ℃的水浴高温环境下可存活15 min,存活率为54.0%，存活率相近但耐受时间更长，体现出了优秀的高温耐受性，可以抵御生产过程中高温处理的影响。文献[21]从奶粉中分离出数株凝结芽孢杆菌,在pH2.0的酸性环境下存活率最高，高于本试验结果，但对高温的耐受能力低于本试验结果。由此分析,在不同环境下分离出的菌株对于酸或高温环境的耐受能力差异明显。MRS-913在pH为1.0的酸环境中可存活4 h，存活率为55.9%，较适应工业食品的发酵。

凝结芽孢杆菌是一种在肠道发挥益生作用的革兰氏阳性菌，文献[22]发现畜禽饲料中的抑菌药可能会影响饲用凝结芽孢杆菌的益生效果。人类食用性的凝结芽孢杆菌的使用更要科学用药，规避“配伍禁忌”。在凝结芽孢杆菌MRS-913对抗生素的敏感性试验中，选用的抗生素对凝结芽孢杆菌MRS-913都有较高的抑制能力，凝结芽孢杆菌MRS-913除对杆菌肽、奥普托欣、林可霉素不敏感，对其他常见抗生素均表现敏感性，表明凝结芽孢杆菌MRS-913不能和这些抗生素共用，否则会影响凝结芽孢杆菌MRS-913发挥益生作用。

分离出的凝结芽孢杆菌MRS-913可作为活菌添加剂添加到动物饲料中，在克服消化道的苛刻条件后，通过胃液环境在小肠定植，在肠道内定植后会分泌纤维素酶，促进饲料消化吸收，降低料肉比。凝结芽孢杆菌通过调节微生物群组成、宿主免疫和代谢，对肠道疾病具有治疗作用，如急性腹泻、肠应激综合征等，此外，毒理学实验和大量临床观察表明，凝结芽孢杆菌是安全的，没有致突变性致畸性活遗传毒性[23]。在生产、储存、运输和管理方面都具高稳定性，其孢子形成能力较强，必然将在未来对人类肠道疾病的治疗中发挥更重要的作用。

4 结论

从土壤中分离出一株产纤维素酶的凝结芽孢杆菌MRS-913，该菌株在100 ℃水浴15 min，其存活率为54.0%，可耐受质量分数为4%的胆盐，在pH为1.0的酸性环境中可存活4 h，存活率为55.9%；在pH分别为1.5、2.5的模拟胃液中能够存活180 min，存活率分别为62.7%和74.8%。且对杆菌肽、奥普托欣、林可霉素不敏感；对阿奇霉素低度敏感；对多黏菌素B、链霉素中度敏感，对四环素等极高度敏感。以上结果可以初步判定，分离出的凝结芽孢杆菌MRS-913具有优良的益生特性，表现出较强的耐高温、耐酸、耐胃液、耐胆盐性能，可作为微生态制剂进一步开发利用。