刘运琴,戢汉斌,肖文昊,林 丽

(1.武汉市武东医院/武汉市第二精神病院精神科,武汉 430084;2.武汉市武东医院/ 武汉市第二精神病院精神康复科,武汉 430084;3.武汉市武东医院/武汉市 第二精神病院老年精神科,武汉 430084;4.湖北中医药大学基础医学院 分子细胞生物学实验室,武汉 430065)

抑郁症是一组以持续心境低落、兴趣减退为主要特征的综合征,常伴有认知功能损害、饮食睡眠障碍、抑制活动减退及各种躯体症状,是全球范围内的常见精神障碍性疾病[1]。近年来抑郁症的发病呈现逐年升高的趋势,WHO预测抑郁症可能成为仅次于心血管疾病的人类第二大致残因素[2]。尽管有大量研究从各个方面对抑郁症的发病原因及机制进行了研究,但目前抑郁症的发病机制仍没有准确的定论。探讨抑郁症的发病机制、早期诊断并给予有效治疗成为国内外学者研究的重点[3]。淫羊藿苷是淫羊藿有效成分的活性单体,具有提高心脑血管血流量、促进造血、骨代谢及延缓衰老等功能[4]。近年来研究发现,淫羊藿苷可穿透血脑屏障发挥抗神经元损伤、促神经突触生长、提高性功能和抗抑郁等作用[5]。张聪等[6]研究发现,淫羊藿苷显著增加皮质酮诱导的抑郁大鼠蔗糖摄入量和海马脑源性神经营养因子(BDNF)水平,降低了强迫游泳实验(forced swim test,FST)的不动时间,具有较强的抗抑郁活性,但其对神经内分泌系统的影响尚不明确。本实验以80只清洁级SD小鼠为观察对象,旨在分析淫羊藿苷影响抑郁动物模型神经内分泌系统功能及其相关机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择清洁级SD小鼠80只,雄性,8周龄,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,实验动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。(23±2)℃、(55±2)%湿度的相对恒定饲养环境,光暗周期为12 h,环境保持安静。本实验动物实验操作均符合《实验动物管理条例》相关标准。淫羊藿苷(纯度>98%)由上海市融禾医药公司提供。

1.2 方法

1.2.1分组

将SD小鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组及高剂量组,其中模型组、低剂量组及高剂量组建立社交应激抑郁模型,对照组不予处理。

1.2.2社交应激抑郁模型建立

以CD1小鼠为定居者,单笼饲养2周。SD小鼠为入侵者,放入定居者的笼子里,为保护自己的领地,定居者会撕咬入侵者,10 min后将定居者与入侵者用带孔的有机玻璃挡板分开,在同一笼子里相处1 d,让入侵者感受到来自定居者的视觉及听觉威胁,而非撕咬。之后将入侵者送入新的定居者笼子里,重复上述操作10 d。最后将SD小鼠单笼饲养,对其进行社交孤立28 d。

1.2.3给药

社交应激10 d后,低剂量组及高剂量组分别给予30、60 mg/kg淫羊藿苷灌胃,对照组及模型组分别给予生理盐水灌胃,给药28 d。

1.3 观察指标

1.3.1社区区域停留时间

在给药28 d后每笼放入新的CD1小鼠,对其进行社会应激,观察并比较各组小鼠社区区域停留时间。

1.3.2旷场试验

在安静室内将小鼠放置于敞箱底面的中心方格内,记录小鼠在5 min中的运动,以穿越底面块数为水平穿越格数,观察各组小鼠水平穿越格数。

1.3.3体重检测

测量小鼠试验后的体重,计算并比较各组小鼠体重水平。

1.3.4血清检测

从心脏采血,于室温静置20 min,以4 000 r/min的转速离心10 min,小心分离血清,放入-70 ℃环境冷藏备用,避免反复冻融。采用酶联免疫吸附试验检测血清白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。

1.3.5下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素 (corticotropin releasing hormone,CRF)水平检测

给药第28天治疗结束后24 h,将小鼠快速断头取下丘脑,称重后放入1 mL生理盐水中煮沸3 min,于匀浆器中均浆,4 ℃ 3 000 r/min离心10 min,取上清液按照CRF放免试剂盒说明书进行操作,检测各组小鼠CRF水平。

1.3.6垂体中促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)及肾上腺皮质肌动蛋白(actin of adrenal cortex,CORT)水平检测

给药第28天治疗结束后24 h,将小鼠快速断头取垂体及肾上腺,称重后放入含10% EDTA-Na230 μL的试管中,于匀浆器中均浆,4 ℃ 3 000 r/min离心10 min,取上清液按照ACTH、CORT试剂盒说明书进行操作,检测各组小鼠ACTH、CORT水平。

1.3.7放射性配基检测糖皮质激素受体(GR)最大结合容量

分离各组小鼠肝脏,PBS冲洗,剪碎、研磨,4 ℃ 175 000 g离心30 min,吸去上清液。BCA法测定蛋白浓度,调整蛋白浓度为10 mg/mL。加入5%的N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC),冰浴3 min,4 ℃ 12 000 r/min离心3 min,吸去上清液。向总结合管和非特异性结合管中每管加入300 μL肝胞液,总结合管中加入[1,2,4-3H]-Dex,非特异结合管中加入[1,2,4-3H]-Dex及非标记Dex。吸上清液400 μL加入5 mL液体闪烁液后用液体闪烁仪测量各管的cpm值。Schatchard分析求得肝胞液GR与3H-Dex特异结合的最大结合容量。

1.3.8Western blot检测GR蛋白表达

取各组小鼠肝组织,加入蛋白裂解液匀浆,冰上裂解,4 ℃ 12 000 r/min离心20 min,取上清液。BCA法定量总蛋白,SDS-PAGE电泳分离。转印至硝酸纤维素膜,室温封闭。加入GR一抗4 ℃过夜。HRP标记二抗,增强化学发光法显色,曝光显影。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠行为学指标水平比较

模型组、低剂量组、高剂量组小鼠水平穿越格数、社区区域停留时间及体重明显低于对照组,低剂量组和高剂量组小鼠水平穿越格数、社区区域停留时间及体重明显高于模型组,且随剂量的增加而升高,差异具有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组小鼠行为学指标水平比较

2.2 各组小鼠炎症指标水平比较

模型组、低剂量组、高剂量组小鼠IL-6、TNF-α水平明显高于对照组,低剂量组和高剂量组小鼠IL-6、TNF-α水平明显低于模型组,且随剂量的增加而降低,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组小鼠炎症指标水平比较

2.3 各组小鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴相关激素水平比较

模型组、低剂量组、高剂量组小鼠CRF、ACTH、CORT水平明显高于对照组,低剂量组和高剂量组小鼠CRF、ACTH、CORT水平明显低于模型组,且随剂量的增加而降低,差异具有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 各组小鼠HPA轴相关激素水平比较

2.4 各组小鼠GR结合力比较

模型组、低剂量组、高剂量组小鼠GR结合力明显低于对照组,低剂量组和高剂量组小鼠GR结合力明显高于模型组,且随剂量的增加而升高,差异具有统计学意义(P<0.05),见表4。

表4 各组小鼠GR结合力比较

2.5 各组小鼠GR蛋白表达水平比较

模型组、低剂量组、高剂量组小鼠GR蛋白水平明显低于对照组,低剂量组和高剂量组小鼠GR蛋白水平明显高于模型组,且随剂量的增加而升高,差异具有统计学意义(P<0.05),见图1。

a：P<0.05,与对照组比较；b：P<0.05,与模型组比较；c：P<0.05,与低剂量组比较。

3 讨 论

抑郁症是由各种原因引起的以抑郁为主要症状的一组心境障碍或情感性障碍。WHO调查显示,目前全球有四亿人患有抑郁症,心理疾病已成为全球第四大疾病[7]。目前治疗抑郁症的药物较多,但仍有33%的患者抗抑郁治疗效果较差,且部分抗抑郁药物长期服用后的不良反应明显,对患者身体伤害较大,因此寻找一种低毒、有效的抗抑郁药成为目前抑郁症相关研究的主要方向[8]。

中医认为,肾虚肝郁是抑郁症的主要证型之一[9]。现代医学认为,肾虚证涵盖了神经-内分泌-免疫免疫网络的紊乱,其中HPA轴及免疫功能紊乱是其主要体现。ZHOU等[10]研究表明,重度抑郁患者存在HPA轴及免疫功能紊乱,这与肾虚证存在相似的病理生理基础。淫羊藿是中医温补肾阳的常见药物,性温,味辛甘,归肝肾经,具有滋补肝肾、壮阳、祛风湿、改善免疫功能、镇静、抑制肠道病毒及强筋骨等功能。淫羊藿苷是由淫羊藿提取、分离、纯化而来,属于黄酮类,具有保护神经、成骨、抗癌、抗炎及抗氧化功能[11]。方丽媛等[12]研究表明,淫羊藿苷可通过提高乙酰胆碱酶和乙酰胆碱转移酶活性降低氧化应激，减轻老年痴呆小鼠类老年痴呆病理症状,且存在一定的剂量依赖性。本实验中,低剂量组、高剂量组小鼠水平穿越格数、社区区域停留时间及体重明显高于模型组,且随剂量的增加而升高。淫羊藿苷可明显改善抑郁小鼠的社交活动,减轻小鼠抑郁状态。

研究[13]认为,免疫系统的过度激活是抑郁症发病的重要机制之一,其中IL-6及TNF-α等神经炎症因子成为研究的重点。TNF-α是由单核巨噬细胞及神经细胞等释放的一种炎症因子。KURANOBU等[14]研究表明,新生幼鼠皮下注射TNF-α,成年后出现抑郁性症状的概率大大升高。IL-6由淋巴细胞及非淋巴细胞释放,可介导炎性反应。本实验中,低剂量组、高剂量组小鼠IL-6、TNF-α水平明显低于模型组,且随剂量的增加而降低。提示淫羊藿苷可通过降低抑郁小鼠炎性反应，改善抑郁症状,与ZHANG等[15]的研究结果相近。

抑郁症患者糖皮质水平低下与慢性炎症并存,GR下调是重要原因之一,MEGAN等[16]研究证明,GR与抑郁存在密切联系,GR下调的转基因小鼠应激后出现抑郁状态的概率较高。HPA轴参与控制机体的应激反应,调节心情、情绪、性行为及免疫系统等心理身体活动,下丘脑分泌的CRH可刺激ACTH的分泌,同时ACTH可调控CORT的表达,而CORT则可反向控制CRH及ACTH的水平[17]。HPA轴是人类行为反应及适应压力的中心。既往研究表明,抑郁症的发生与HPA轴功能亢进存在密切联系[18]。NORMANN等[19]研究表明。老年抑郁症患者自杀发生率与HPA轴紊乱存在一定联系,密切监测HPA轴的变化可明显降低患者自杀率。本实验中,低剂量组、高剂量组小鼠GR结合力及GR蛋白水平明显高于模型组,且随剂量的增加而升高。低剂量组、高剂量组小鼠CRF、ACTH、CORT水平明显低于模型组,且随剂量的增加而降低。提示淫羊藿苷良性调整抑郁小鼠社交行为及神经内分泌功能可能与淫羊藿苷通过调控GR蛋白水平调节CRF及HPA轴相关激素表达有关。

综上所述,淫羊藿苷可良性调整抑郁小鼠社交行为及神经内分泌功能,降低小鼠慢性炎性反应,其机制可能与淫羊藿苷通过调控GR蛋白水平调节CRF及HPA轴相关激素表达有关。