胡梦艺　江一静　饶婷　杨珊莉

摘要 目的：基于突觸可塑性观察电针曲池、足三里对大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠运动障碍的改善。方法：将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、穴位组、非穴组，每组15只。采用Zea Longa线拴法制备MCAO大鼠模型，电针曲池、足三里，干预14 d。通过神经功能评分判断大鼠的神经功能缺损情况;CatWalk步态分析比较各组大鼠运动功能，TTC染色观察脑梗死体积，透射电镜观察突触超微结构和数量，免疫荧光检测缺血侧运动皮层突触相关因子突触后致密物-95（PSD-95）、突触蛋白的表达情况。结果：干预14 d后，与模型组比较，穴位组大鼠神经功能评分降低（P<0.05）;步行速度提高、双足支撑时间缩短（P<0.05）;脑梗死体积减少（P<0.05）;突触超微结构改善明显，突触数量增加（P<0.05），突触相关因子突触蛋白、PSD-95表达上调（P<0.05）。Catwalk步态参数、脑梗死体积与突触超微结构改善有一致性。结论：电针曲池、足三里穴可改善MCAO大鼠运动障碍，其机制可能与上调突触相关因子的表达，改善突触可塑性有关。

关键词 脑卒中;电针;运动功能;突触可塑性;机制研究;大脑中动脉闭塞;突触后致密物-95;突触素

Mechanism of Electroacupuncture in Improving Dyskinesia in MCAO Rats Based on Synaptic Plasticity

HU Mengyi，JIANG Yijing2，3，RAO Ting1，2，YANG Shanli2，3

（1 Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China; 2 Rehabilitation Hospital Affiliated to Fujian University

of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China; 3 Key Laboratory of Rehabilitation Technology，Fuzhou 350003，China）

Abstract Objective：To observe the effect of electroacupuncture（EA） at “Quchi（LI 11）” and “Zusanli（ST 36）” on the dyskinesia in middle cerebral artery occlusion（MCAO） rats based on synaptic plasticity.Methods：Sixty male SD rats were randomly divided into a sham operation group，a model group，an acupoint group，and a non-acupoint group，with 15 rats in each group.The MCAO model was induced in rats by the Zea-Longa method.EA treatment at “Quchi（LI 11）” and “Zusanli（ST 36）” was carried out for 14 days.The neurological deficits of rats were evaluated by the score of the Neurological Impairment Scale.The motor functions of rats in each group were compared by the CatWalk-assisted gait analysis system.TTC staining was used to observe the cerebral infarction volume.The ultrastructure and number of synapses were observed by transmission electron microscopy（TEM）.The expression of synapse-related factors PSD-95 and synapsin in the ischemic motor cortex was detected by immunofluorescence assay.Results：After 14 days of intervention，compared with the model group，the acupoint group showed decreased neurological deficit score（P<0.05），quickened walking，shortened bipedal stance time（P<0.05），reduced cerebral infarction volume（P<0.05），improved synapse ultrastructure，increased number of synapses（P<0.05），and up-regulated expression of synapse-related factors synapsin and PSD-95（P<0.05）.Catwalk gait parameters and cerebral infarction volume were consistent with synaptic ultrastructure improvement.Conclusion：EA at “Quchi（LI 11）” and “Zusanli（ST 36）” can improve dyskinesia in MCAO rats，and the mechanism may be related to the up-regulation of the expression of synaptic-related factors and the improvement of synaptic plasticity.

Keywords Stroke; Electroacupuncture; Motor function; Synaptic plasticity; Mechanism research; MCAO; PSD-95; Synapsin

中图分类号：R245;R743.3文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.007

最新全球疾病负担研究的系统分析表明，脑卒中是影响50岁以上人群致死和致残的主要原因[1]。由于该疾病具有致残率高、死亡率高的特点，患者常留下多种后遗症，运动功能障碍是常见的后遗症之一，影响着70%～80%的脑卒中患者[2]。脑卒中后运动障碍是一种不自主的异常运动模式，严重影响患者的日常生活，给家庭、社会带来一定的压力与负担[3]。

运动障碍的症状与缺血中心神经元死亡导致的正常神经功能的中断有关。神经网络发挥生理功能的基础是神经元之间相互形成的神经突触及介导信息传递，缺血后突触结构的完整性损害，中断传输信号，导致感觉运动功能受损[4-5]。由于突触是递质和受体的功能单位，因此是整个中枢系统细胞间信号传递的基本结构[6]。突触超微结构的改变很大程度上反映出神经系统的可塑性，是缺血再灌注损伤后脑可塑性的基础。针灸是中医学的瑰宝，从古至今被广泛应用于脑血管疾病的治疗。《针灸甲乙经》等169部医籍治疗中风半身不遂或瘫痪的统计结果显示，曲池、足三里使用频率最高、相互配伍也最为常见[7-8]。临床研究已证明针灸治疗可降低脑卒中的致残率与复发率，但作用机制未阐明[9-11]。

突触后致密物-95（Postsynaptic Density-95，PSD-95）作为信号复合物，具有促突触连接的形成、维持突触可塑性的生物学功能，在反应性突触形成中起关键作用，突触蛋白与突触功能和结构关系密切，被用作突触数量的指示剂，二者都是突触可塑性标志物[12-13]。本研究观察电针曲池、足三里对MCAO大鼠突触超微结构及PSD-95、突触蛋白表达的改变，旨在基于突触可塑性以研究电针治疗患侧曲池、足三里改善脑卒中后遗留的运动功能障碍的中枢机制，为临床电针治疗缺血性脑卒中提供理论与实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8周龄雄性的健康SD大鼠60只（220～280 g），无特定病原（Specific Pathogen-free，SPF）级，购自浙江省医学科学院[许可证号SCXK（浙）2019-0002]，喂养于本校的实验动物中心。室温下自由饮食水，模拟标准日夜系统，相对湿度30%～60%，温度21～23 ℃。此实验经福建中医药大学伦理委员会批准并同意（伦理审批号：2020035），并在饲养和使用实验动物时遵守“减少、优化和替代”的原则给予充分的人道主义关怀。

1.1.2 试剂与仪器 线栓：深圳瑞沃德生命科技有限公司。电针仪：无锡佳健医疗器械有限公司。Catwalk步态分析系统：荷兰Noldus信息技术有限公司。透射电镜：H7650，HITACH日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 60只SPF雄性SD大鼠，适应性喂养1周，采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、穴位组、非穴组，每组15只。4组大鼠的鼠龄、体质量等一般资料经统计学分析，差异无统计学意义（P<0.05），具有可比性。采用改良的Longa等[14]用线栓法开展MCAO动物模型的制备，实验动物术前禁食不禁水12 h，用10%的水合氯醛以0.35 mL/kg的比例对各组大鼠腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉充分后以仰卧位于手术板固定，依次备皮消毒。沿颈部正中间以一垂直的约2 cm的竖切口切开皮肤，钝性分离各肌群、肌肉，直至暴露右侧的颈总动脉，逐渐细致分离迷走神经、颈内动脉、颈外动脉。使用4-0的缝合线充分结扎颈总动脉远端及颈外动脉，使用动脉夹将颈内动脉夹闭，并用血管剪在分叉口剪一小切口，将一根带有硅胶端包裹的鱼线插入颈内动脉（18～22 mm），至感觉有轻微阻力，闭塞大脑中动脉。用缝合线将颈内动脉及鱼线固定，缝合皮肤并消毒。90 min后拔出线10～15 mm恢复再灌注。假手术大鼠除闭塞大脑中动脉外，均进行以上相同的操作。

1.2.2 干预方法 4组大鼠术后均进行Longa评分并回笼饲养，分组情况对评估者设盲。第2天进行干预，对假手术组及模型组的大鼠进行点按患侧肢体曲池穴及足三里穴，频率为1次/d;穴位组进行患侧电针曲池穴及足三里穴（取穴方法参照实验大鼠腧穴图谱[15]）;非穴组在穴位附近选一点扎针。针具选用0.5寸毫针（华佗牌），针刺深度3 mm，进针后提插捻转，随后接上华佗牌电针仪，采用疏密波，频率1～20 Hz，电压峰值为6 V，见大鼠肢体肌肉微微颤动为标准，30 min/次，1次/d。4组大鼠共持续干预14 d，至处死。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 神經行为学评分 分别测试4组大鼠术后24 h以及干预14 d的神经行为学评分，具体分组情况对评估者施盲，参考Longa等[14]5级4分法的评分标准评定神经功能，1～3分表明造模成功可纳入模型组，0分及4分不符合纳入标准则剔除。具体评分标准：0分：正常，大鼠未出现神经损伤症状;1分：大鼠患侧前肢不能完全伸展，出现轻度神经功能缺损表现;2分：步行时，大鼠右侧转圈，出现中度神经功能缺损表现;3分：步行时，大鼠向右侧倾倒，出现中度神经功能缺损表现;4分：大鼠意识丧失，无法进行自发性行走。

1.2.3.2 CatWalk步态分析 所有大鼠进行为期1周的适应性CatWalk训练，训练过程中数据不做记录，主要目的为使大鼠充分熟悉跑道的环境，以便正式测试时达到测试所需的要求。训练前需禁食但不限水，每次完成训练后每只大鼠给予12～15 g饲料，以控制体质量及培养实验动物形成稳定奖励机制。采集术后24 h、干预14 d的步态参数。训练方法：打开电脑、CatWalk跑道灯、摄像头灯等所有相关设备，并使实验室房间无其他明显光源，使大鼠平稳进入CatWalk跑道，让其在任何刺激的情况下自发地、不停顿地通过跑道。测试的大鼠在5 s内无中断及大致匀速地通过跑道3次，且采集范围内的单次总步数不少于6步。

1.2.3.3 TTC染色 干预14 d后，各组大鼠随机取5只，处死取脑，将脑组织-20 ℃冰冻5 min，置于冰上脑模内，沿冠状切面以脑腹侧视交叉为中点切成2 mm的组织片，连续切5片。将切片置于1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium Chloride，TTC）磷酸缓冲液中，在37 ℃避光染色20 min，然后用10%甲醛溶液固定，并采用Image J 1.36b软件计算大鼠缺血侧脑梗死体积的百分比。白色为梗死区域，红色为未梗死区域。见图1。

1.2.3.4 透射电镜观察超微结构 各组大鼠干预14 d后，每组随机选取5只进行麻醉，夹闭腹主动脉，于心尖、右心耳处剪一开口，心尖处灌注生理盐水300 mL，再注入预冷的4%多聚甲醛进行脑组织灌流固定，小心取体积为1 cm的缺血侧脑组织皮质浸泡于2%多聚甲醛-2.5%戊二醛磷酸缓冲液中充分固定24 h，随后取出组织用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）漂洗3次，10 min/次，1%锇酸磷酸缓冲液固定1.5 h再次漂洗，取出组织后进行常规脱水、包埋，随后将包埋的组织块置于60 ℃烘干箱中聚合48 h后至硬化。将包埋块带组织的一段粗修至暴露组织，后修切成厚度1 μm的半薄切片，修去树脂等边缘组织使切面呈梯形再用超薄刀片将其切成90 nm薄片，铜网捞片干燥后进行染色，透射电子显微镜下观察每个铜网内标本的超微结构。

1.2.3.5 免疫荧光检测Synaspsin、PSD-95的表达 各组大鼠造模14 d后，腹腔注射麻醉后，夹闭腹主动脉，于心尖、右心耳处剪一开口，心尖处灌注生理盐水300 mL，再注入预冷的4%多聚甲醛进行脑组织灌流固定，小心取出形态完整的脑组织，经4%多聚甲醛固定36 h，经脱水处理后石蜡包埋后，制成厚度为5 μm、均匀、无刀痕、无皱褶的组织切片，将切片脱蜡至水、修复抗原后经PBS漂洗，室温下用5%山羊血清封闭120 min，滴加一抗（突触蛋白、PSD-95鼠多克隆抗体，浓度1∶300），4 ℃过夜。次日复温30 min后对切片进行PBS漂洗，滴加荧光二抗（山羊抗鼠和山羊抗兔浓度为1∶300），避光37 ℃孵育0.5 h。经PBS漂洗3遍，用含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的抗荧光淬灭封片剂进行封片。于荧光显微镜下观察缺血侧脑皮质。每组选取5只大鼠不同位置的脑切片3张，在相同放大倍数、相同参数条件下，每张脑组织切片随机选取4个视野照相，使用Image J软件统计突触蛋白、PSD-95阳性细胞数目。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行數据分析，结局统计由本研究不知情者完成。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析法及LSD法统计。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Zea-Longa评分比较 实验大鼠术后24 h，与假手术组大鼠比较，模型组、穴位组及非穴组大鼠Zea-Longa评分均升高，说明MCAO术后动物表现出明显的神经运动功能障碍，但模型组、穴位组与非穴组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠干预前后CatWalk系统中步行速度比较 干预14 d后，穴位组大鼠步行速度明显快于非穴组，2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠干预前后CatWalk系统中双足支撑时间比较 各组大鼠干预14 d后，穴位组大鼠双足支撑时间明显少于非穴组，2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠干预前后脑梗死体积比较 TTC染色结果显示，假手术组大鼠脑组织无明显脑梗死区域。模型组、穴位组和非穴组大鼠均有明显梗死灶，与假手术组比较，差异均有统计学意义（均P<0.01）;与模型组比较，穴位组和非穴组大鼠梗死体积显著减小，差异均有统计学意义（均P<0.01）;与非穴组比较，穴位组脑梗死体积较小，差异有统计学意义（P<0.01）。见表4。

2.5 各组大鼠透射电镜超微结构变化 通过透射电镜观察可见假手术组突触间隙清晰，突触前后膜结构清晰，前膜内突触可见囊泡多且分布均匀、密集，突触后致密带密度高。模型组与假手术组比较，突触间隙模糊，突触前后膜模糊，前膜内突触的囊泡密度不均、数量少，突触后致密带密度较低，突触数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）;非穴组、穴位组与模型组比较，突触间隙较清晰、突触前后膜较清晰可见、前膜内可见突触囊泡较分布密集且较均匀、丰富，突触后致密带密度高，突触数量明显增多，尤其是穴位组的突触形态结构的改善程度优于非穴组，在穴位组不同组别中，随着电针干预时间的延长，突触形态结构改善越明显，突触数量增加越多，2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、图3。

2.6 各组大鼠Synapsin、PSD-95表达比较 免疫荧光结果显示大鼠经过MCAO造模术后突触蛋白、PSD-95水平急剧减少，进行电针干预后突触蛋白、PSD-95表达有所上调，其中穴位组上调的趋势较非穴组明显，且具有一定的时间依赖性。见图4～5。

3 讨论

脑卒中是严重危害人类健康的疾病。近年来，大量临床试验证实了电针在治疗脑卒中方面的疗效确切，包括改善肢体运动功能、吞咽障碍以及言语困难等症状，对其治疗机制研究也日益深入[16-17]。《素问·痿论篇》曰“论言治痿者，独取阳明”，可见阳明经在治痿中的重要性，曲池、足三里分别为手、足阳明经之合穴，调理气血、濡养筋脉，为中风痿痹康复治疗常用穴位。已有基础研究揭示了电针曲池、足三里在减轻脑缺血损伤方面的分子和生物物理相关性[18-19]。另有研究表明，实验性脑缺血模型经过电针曲池、足三里干预后梗死体积缩小，感觉、运动皮层葡萄糖代谢增加，同时CatWalk步态分析结果和Rota-rod测试表现出运动功能改善的趋势[20]。本研究结果表明，电针曲池、足三里能有效改善MCAO大鼠的神经行为学表现（P<0.05），CatWalk步态分析结果显示穴位组大鼠的步行速度提高（P<0.05），双足支撑时间减少（P<0.05），脑梗死体积减少（P<0.05），与以往研究结果类似。

脑缺血后神经功能的关键分子基础是突触可塑性，神经元间突触的改变会促进机体更加适应环境的改变，即突触可塑性[21]。突触可塑性是指突触链接在形态上和功能上的修饰，主要是指突触在一定条件下调整功能、改变形态和增减数目的能力，包括突触传递效能的变化和突触结构的改变，缺血后突触可塑性作为一个修复过程，可通过增加树突分支，特别是Ⅲ层多极神经元并重建脑半球间的轴突连接;也通过新生的轴突芽，建立新的神经环路，促进新生神经元的投射[22-23]。因此突触可塑性有助于脑卒中后神经功能的恢复。目前，许多促进突触可塑性的治疗已被证明对缺血性损伤有保护作用[24]，因此我们选用与突触形态功能密切相关的突触可塑性标志物PSD-95、Synapsin作为观察指标，以进一步确定电针曲池、足三里对突触可塑性的影响。PSD-95是衡量突触可塑性的关键蛋白之一，以往研究将其作为衡量突触可塑性的主要指标之一[25]。Synapsin是一种钙结合蛋白，位于突触前囊泡膜上，参与突触可塑性的调节[26]。我们通过免疫荧光染色、透射电镜观察，进一步确定电针对突触可塑性的影响。实验结果表明，电针上调了PSD-95和Synapsin的表达，改善了突触的超微结构。本研究数据与以前的研究结果相似，即PSD-95和Synapsin表达的上调，电针可促进突触可塑性[27]。

综上所述，电针患侧曲池穴、足三里穴14 d可减少MCAO大鼠缺血侧脑梗死体积，有益于促进缺血侧皮质突触的可塑性，从而提高MCAO后运动功能水平及改善神经功能缺损情况。本研究将为临床应用电针干预以改善缺血性脑卒中提供了相应的实验依据，为针刺干预防治脑卒中后运动障碍的中枢机制提供了研究思路。

参考文献

[1]GBD 2016 Neurology Collaborators.Global，regional，and national burden of neurological disorders，1990-2016：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016[J].Lancet Neurol，2019，18（5）：459-480.

[2]Langhorne P，Coupar F，Pollock A.Motor recovery after stroke：a systematic review[J].Lancet Neurol，2009，8（8）：741-754.

[3]Mehanna R，Jankovic J.Movement disorders in cerebrovascular disease[J].Lancet Neurol，2013，12（6）：597-608.

[4]Cirillo C，Brihmat N，Castel-Lacanal E，et al.Post-stroke remodeling processes in animal models and humans[J].J Cereb Blood Flow Metab，2020，40（1）：3-22.

[5]Mattson MP，Moehl K，Ghena N，et al.Intermittent metabolic switching，neuroplasticity and brain health[J].Nat Rev Neurosci，2018，19（2）：63-80.

[6]Miyamoto A，Wake，H，Ishikawa AW，et al.Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex[J].Nat Commun，2016，7：12540.

[7]張义，任玉兰，王兴丽，等.现代针灸治疗中风偏瘫选穴处方规律研究[J].辽宁中医药大学学报，2012，14（9）：61-64.

[8]闫朝升，李丹，隋思逸，等.基于多维数据分析技术探析古代针灸治疗中风半身不遂症的用穴规律[J].中医药学报，2015，43（4）：22-27.

[9]Zhan J，Pan R，Zhou M，et al.Electroacupuncture as an adjunctive therapy for motor dysfunction in acute stroke survivors：a systematic review and meta-analyses[J].Bmj Open，2018，8（1）：e17153.

[10]Cai Y，Zhang CS，Liu S，et al.Electroacupuncture for Poststroke Spasticity：A Systematic Review and Meta-Analysis[J].Arch Phys Med Rehabil，2017，98（12）：2578-2589.e4.

[11]代玲玲，徐榛敏，梁晓，等.近三年针刺治疗急性缺血性脑卒中随机对照试验中结局指标现状分析[J].中国中药杂志，2021，46（12）：2949-2962.

[12]王雪岩，郭易楠，阴赪宏.PSD-95的生物学功能与应用研究进展[J].临床和实验医学杂志，2018，17（18）：2015-2017.

[13]Liu P，Li C，Zhang B，et al.Constraint induced movement therapy promotes contralesional-oriented structural and bihemispheric functional neuroplasticity after stroke[J].Brain Res Bull，2019，150：201-206.

[14]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91.

[15]徐东升，赵硕，崔晶晶，等.绘制实验大鼠腧穴图谱的新尝试[J].针刺研究，2019，44（1）：62-65.

[16]王丹丹，赵斯文.电针疗法联合康复治疗对急性缺血性脑卒中患者运动功能恢复的临床观察[J].现代实用医学，2019，31（4）：16-17.

[17]叶佳踪，吴登宠，金永喜.电针刺激拮抗肌侧腧穴联合康复训练治疗脑卒中后肌张力增高患者的临床观察[J].中国中医急症，2018，27（12）：2200-2202.

[18]Chang QY，Lin YW，Hsieh CL.Acupuncture and neuroregeneration in ischemic stroke[J].Neural Regen Res，2018，13（4）：573-583.

[19]Lina C，Huang SS，Iona MD，et al.Mechanisms of Acupuncture Therapy in Ischemic Stroke Rehabilitation：A Literature Review of Basic Studies[J].Int J Mol Sci，2017，18：1-2.

[20]Wu J，Lin B，Liu W，et al.Roles of electro-acupuncture in glucose metabolism as assessed by 18F-FDG/PET imaging and AMPKα phosphorylation in rats with ischemic stroke[J].Int J Mol Med，2017，40（3）：875-882.

[21]Murphy TH，Corbett D.Plasticity during stroke recovery：from synapse to behaviour[J].Nat Rev Neurosci，2009，10（12）：861-872.

[22]Joy MT，Carmichael ST.Encouraging an excitable brain state：mechanisms of brain repair in stroke[J].Nat Rev Neurosci，2021，22（1）：38-53.

[23]Theresa JA.Motor compensation and its effects on neural reorganization after stroke[J].Nat Rev Neurosci，2017，18（5）：267-280.

[24]Luo Y，Xu NG，Yi W，et al.Study on the correlation between synaptic reconstruction and astrocyte after ischemia and the influence of electroacupuncture on rats[J].Chin J Integr Med，2011，17（10）：750-757.

[25]El-Husseini AE，Schnell E，Chetkovich DM，et al.PSD-95 involvement in maturation of excitatory synapses[J].Science，2000，290（5495）：1364-1368.

[26]Cesca F，Baldelli P，Valtorta F，et al.The synapsins：key actors of synapse function and plasticity[J].Prog Neurobiol，2010，91（4）：313-348.

[27]謝峥嵘，肖豆，唐雅妮，等.电针心包经穴对MCAO大鼠血清和脑组织突触素及突触后致密物-95表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2021：28（1）：81-85.

（2021-05-06收稿 本文编辑：芮莉莉）

基金项目：国家自然科学基金项目（81904268）;福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目（2019-ZQN-81）;中医药循证能力-专科专病循证能力提升项目（2019XZZX-GK001）

作者简介：胡梦艺（1994.01—），女，硕士研究生在读，研究方向：神经康复与认知科学研究，E-mail：562412701@qq.com

通信作者：杨珊莉（1979.09—），女，博士，教授，研究方向：中西医结合康复学，E-mail：49688400@qq.com