李浩然　李维英　吴宏赟　彭伟　周嘉培

摘要 目的：基于分子對接与数据挖掘研究生姜解半夏毒的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索生姜有效成分，通过SwissTargetPrediction数据库预测生姜成分靶点，经Swiss-model同源建模半夏凝集素后进行分子对接。通过DisGeNET数据库获取炎症相关靶点，通过基因映射获取生姜治疗炎症的作用靶点。应用String构建靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并筛选关键基因。对靶点基因进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。结果：筛选得到生姜有效成分5种，与半夏凝集素均有较强结合力。生姜治疗炎症靶点49个，关键靶点有15个，包括MMP9、HSP90AA1、PPARG、RELA、APP、ICAM1、MMP2、mTOR等。通过GO与KEGG富集分析，49个靶点基因涉及急性炎症反应、炎症反应的调节、炎症介质的产生、T细胞的激活、淋巴细胞迁移生物过程，且主要富集于Th17细胞分化相关通路。结论：生姜对半夏毒性成分产生抑制作用并通过减轻炎症反应来发挥解毒作用。

关键词 生姜;半夏;半夏凝集素;毒性;同源建模;分子对接;信号通路;炎症

Mechanism of Zingiberis Rhizoma Recens in Detoxification of Pinelliae Rhizoma

Based on Molecular Docking and Data Mining

LI Haoran，LI Weiying，WU Hongyun，PENG Wei，ZHOU Jiapei

（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 2 Weifang Maternal and Child Health Hospital，

Weifang 261011，China; 3 Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Zingiberis Rhizoma Recens in the detoxification of Pinelliae Rhizoma based on molecular docking and data mining.Methods：The chemical ingredients of Zingiberis Rhizoma Recens were obtained from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）.The targets related to Zingiberis Rhizoma Recens were predicted from SwissTargetPrediction.Molecular docking was carried out after homologous modeling of agglutinin from Pinelliae Rhizoma by Swiss-model.Targets related to inflammation were screened out from DisGeNET，and the targets of Zingiberis Rhizoma Recens against inflammation were obtained by gene mapping.The protein-protein interaction（PPI） network of Zingiberis Rhizoma Recens in the treatment of inflammation was delineated by String，and the key genes were screened out.Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analyses were performed on target genes.Results：Five types of active compounds of Zingiberis Rhizoma Recens had strong binding force with agglutinin from Pinelliae Rhizoma.There were 49 targets of Zingiberis Rhizoma Recens in the treatment of inflammation，and 15 were key ones，including MMP9，HSP90AA1，PPARG，RELA，APP，ICAM1，MMP2，and mTOR.As revealed by GO and KEGG enrichment analyses，49 target genes were involved in biological processes such as acute inflammatory response，regulation of inflammatory response，inflammatory mediator production，T cell activation，and lymphocyte migration，and mainly enriched in the signaling pathways related to Th17 cell differentiation.Conclusion：Zingiberis Rhizoma Recens can inhibit the toxicity produced by Pinelliae Rhizoma by reducing inflammatory responses.

Keywords Zingiberis Rhizoma Recens; Pinelliae Rhizoma; Pinelliae Rhizoma agglutinin; Toxicity; Homologous modeling; Molecular docking; Signaling pathways; Inflammation

中图分类号：R289.5;R282文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.003

半夏为天南星科植物半夏的块茎，经炮制后入药，味辛，性温，具有温化寒痰之功效。然而生半夏多有毒，体现为对舌、咽喉具有强烈的刺激性，使口腔、舌咽麻木肿胀，出现恶心呕吐等胃肠道症状，甚至影响呼吸，导致支气管痉挛麻痹而死亡。半夏的应用历史悠久，生姜可使半夏的毒性大大降低，早在《长沙药解》就有记载：“洗去白矾用，妊娠姜汁炒。”《肘后备急方》中记载：“中半夏毒，生姜汁解之。”《中药大辞典》指出：“生姜解半夏、天南星及鱼蟹、鸟兽肉毒。”并将半夏的炮制法总结为姜半夏、清半夏、法半夏、生半夏4种。目前国内对于生姜解半夏毒的研究存在不同意见，一种观点认为生姜对降低半夏毒性并无作用，姜半夏炮制过程中加入的明矾才是降低毒性的真正原因;另一种观点认为生姜能抑制多种炎症介质，通过缓解炎症反应来降低半夏的毒性[1]。然而，2种观点均未涉及生姜对半夏毒性成分是否存在直接抑制作用。目前国内学者已对半夏的毒性进行了深入研究，发现半夏中主要的毒性成分半夏毒针晶是一种由草酸钙和半夏凝集素（Pinellia Ternata Agglutinin，PTA）组成的复合物，其刺入舌头和咽喉的组织中破坏细胞，引发炎症反应[2]。已有实验表明，使用明矾溶液浸泡半夏毒针晶后，溶液中的AL3+与草酸钙中的CO2-結合，能破坏草酸钙的结构，从而证明了明矾的解毒作用[3]。另有实验发现生姜能抑制白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）的分泌与拮抗半夏所致渗出液中前列腺素E（Prostaglandin E，PGE）的增加，证明了生姜能够通过缓解炎症反应来降低半夏的毒性[4-5]。然而生姜能否对半夏毒针晶中的PTA产生直接抑制作用以及生姜对抗半夏所引起炎症反应的机制仍未完全明了，本研究借助生物信息学就这两方面展开进一步研究。

1 资料与方法

1.1 生姜活性成分及作用靶点的提取 从中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中检索生姜的化学成分，并将上述检索得到的化学成分根据药代动力学（ADME）参数筛选有效成分，筛选条件为口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18。并根据筛选得到的有效成分，进一步提取并预测其对应的作用靶点。

1.2 PTA的同源建模 在进行分子对接前，需要确定蛋白质的空间结构。蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）是目前最主要的收集生物大分子结构的数据库，而PDB数据库未收录PTA结构信息，因此需要通过在线同源建模系统Swiss-model来构建PTA的同源模型。首先从NCBI Protein数据库检索“Pinellia ternata agglutinin”，将检索得到编号为AEZ35184.1的PTA序列输入Swiss-model同源建模系统，Swiss-model根据蛋白序列找到1 361种已知蛋白模板，选择其中最优3种模板（5d5g.2.B、5j76.1.A、5ayw.1.B）进行下一步运算，经过计算得到3种PTA结构模型，经GMQE、QMEAN评价后，选择最可靠的由5d5g.2.B构建的模型确定为PTA结构[6]。应用QMEAN对构建的PTA结构进行整体能量分析。

1.3 生姜有效成分与PTA分子对接 通过PubChem数据库下载有效成分的化学结构式，并利用Chem 3D将其转化为2D结构。将同源建模得到的PTA结构通过Discovery Studio预测活性位点，使用AutoDock Tools加氢、计算电荷、分配原子类型后，使用Autodock vina进行分子对接，最后采用Discovery Studio分析对接结果。PTA具有类似金字塔的外形结构，因蛋白本身不含配体，活性位点未知，故需要预测PTA活性位点。经过Discovery Studio运算得到PTA活性位点。配体与受体结合越稳定其结合能量越低，生姜的5种有效成分中Clionasterol与PTA的结合能最低，结合最稳定，因此以Clionasterol与PTA为例，简要分析分子对接结果。

1.4 炎症疾病基因的获取 DisGeNET是目前涵盖人类疾病基因最丰富的数据库之一，以“Inflammation”作为检索词，寻找炎症的相关基因。

1.5 预测生姜有效成分作用靶点并与疾病基因匹配 从TCMSP下载生姜有效成分的mol2结构文件，使用Babel转换工具将结构文件转换为SMILE格式，并将这5种有效成分的SMILE格式输入SwissTargetPrediction，预测其作用靶点。Uniprot是国际知名的蛋白质数据库，生姜有效成分作用的靶点蛋白在Uniprot中均有与其对应的Gene Symbol。将靶点蛋白Gene Symbol与炎症相关基因进行匹配，并取交集，得到生姜对炎症有治疗作用的靶点。随后对靶点进行String分析，以提取其关键作用靶点。

1.6 靶点蛋白的富集分析 使用Cytoscape插件ClueGo对靶点蛋白进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析生物过程（Biological Process，BP）功能富集分析与京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，研究生姜治疗炎症的生物过程，研究其治疗炎症的作用通路，获得各通路相关网络图，并根据重要程度绘制信号通路占比饼状图。

2 结果

2.1 生姜有效成分 共得到5种生姜有效成分。见表1。

2.2 PTA结构 PTA结构域上的残基对于模板（5d5g.2.B）上的残基，大都保持0.8以上的相似度，具有较好的相似性。PTA同源模型具有较高的稳定性。见图1。

PTA结构模型的整体能量值为-0.66（能量值越接近0稳定性越好），能量值较低，符合模型稳定性要求。PTA结构模型的全球模型质量估计（Global Model Quality Estimation，GMQE）评分（评分越高可信度越高）为0.21，可信度较高。见图2。

2.3 生姜有效成分与PTA分子对接 PTA活性位点见图3，红色球体为PTA活性位点，5种有效成分在此位点与PTA结合。5种有效成分与PTA结合能均<-5.0 kcal/mol（1 cal=4.184 J），5种有效成分与PTA均有很好的结合力。见表2。

Clionasterol与PTA在活性位点发生结合，并与活性位点附近的氨基酸存在相互作用，其a环与Trp186、Phe231、Trp218形成疏水作用，与Trp186形成π-sigma作用;a、b环间的甲基与Leu179形成疏水作用;b环与Phe238形成疏水作用;c环与Lys183形成疏水作用。其结合方式见图4。其余4种生姜有效成分与PTA的结合方式见表3。

2.4 生姜有效成分的靶点预测与炎症基因的获取 从TCMSP筛选出生姜有效成分共5种，共得到289个作用靶点。炎症相关基因467个。生姜（Ginger）治疗炎症的作用靶点49个。见图5。49个作用靶点PPI网络见图6。Count值筛选出前15位靶点为关键靶点。见图7。

2.5 靶点蛋白的GO功能富集分析 49个基因的富集结果主要集中在急性炎症反应（Acute inflammatory response）、炎症反应的调节（Regulation of inflammatory response）、炎症介质的产生（Cytokine production involved in inflammatory response）、T细胞的激活（T cell activation involved in immune response）、淋巴细胞迁移（Lymphocyte migration）、神经炎症反应（Neuroinflammatory response）、白细胞介素-12的正向调节（Positive regulation of interleukin-12 production）等炎症相关过程。见图8。

2.6 靶点蛋白的KEGG富集分析 靶点蛋白KEGG信号通路富集分析发现，42.11%的基因显著富集在Th17细胞分化（Th17 cell differentiation）相关信号通路，此外癌症相关通路（Pathways in cancer）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）也存在富集，占比分别为28.95%、10.53%。见图9、图10。

3 讨论

3.1 分子对接的意义 分子对接（Molecular Docking）是一种从已知结构的受体和配体出发，通过化学计量方法计算其分子间作用力以进行分子间相互作用识别的生物信息学方法。首先，分子对接技术可以极大提高药物研究的效率。药物研究过程一般是先找到在分子和细胞水平活性较好的化合物，然后再进行动物实验，在这个过程中，利用分子对接找到活性较好、与目标靶点结合度较好的小分子化合物，能更有效地减少人力、物力和时间成本。其次，小分子化合物能够与靶标生物大分子作用并抑制或激活蛋白质的生物功能[7]。因此依靠分子对接技术分析生姜有效成分与PTA的结合程度，能够预测生

姜有效成分对PTA有无直接作用，为接下来的基础验证实验提供方向并对进一步研究具有指导意义。

3.2 生姜对PTA的作用探讨 南京中医药大学学者史闰均等[8]进行的与生姜解半夏毒相关的动物实验表明，生姜灌胃给药能明显减轻半夏所致的炎症反应，包括抑制小鼠毛细管通透性增加，降低炎症介质PGE的释放，减轻大鼠足肿胀的程度。说明生姜确实可以降低因服用半夏而导致的炎症反应。然而，实验中生姜汁均为灌胃给药，半夏毒针晶生理盐水混悬液均为局部注射，二者不存在直接接触，无法说明生姜有效成分对半夏毒针晶及PTA存在直接抑制作用。而南京中医药大学吴皓等[9]进行的一项小鼠扭体实验表明生姜汁配置的半夏混悬液与生理盐水配置的半夏混悬液比较能显著降低小鼠扭体发生率。本实验生姜汁与半夏汁混合后通过腹腔注射进入小鼠体内，生姜有效成分与半夏毒性成分直接接触。因此，有理由作出生姜有效成分对半夏毒性成分可能存在直接抑制作用的假设。为验证这一假设，本研究通过分子对接技术，分析生姜有效成分与PTA的结合能力。

分子对接结果表明，生姜的5种有效成分与PTA结合较强，因为小分子化合物能够与靶标生物大分子作用并抑制或激活蛋白质的生物功能，所以生姜有效成分对半夏毒性成分半夏毒针晶中的PTA很可能存在直接抑制作用，通过与小分子配体与蛋白质受体结合，抑制PTA的生物功能或破坏半夏毒针晶的结构[7]。然而此项结论并不严谨，因为分子对接是基于计算机运算的结果，仍需要基础实验验证。目前国内有关生姜与半夏凝集素的研究仍较空白，本研究的分子对接结果有助于为相关实验研究提供思路。

3.3 生姜减轻炎症反应的机制研究 相关实验表明生姜能够明显减轻半夏所致的炎症反应，然而其抗炎机制仍未明了[8]。本研究通过基因映射发现生姜治疗炎症的靶点主要为MMP9、HSP90AA1、PPARG、RELA、APP、ICAM1、MMP2、mTOR。MMP9具有抗炎特性，其与口腔炎症密切相关，有实验表明敲除基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）9基因动物的牙周病变更大，炎症反应更强，提示MMP9在炎症反应中发挥重要作用[10-11];MMP2和MMP9所编码的蛋白属于MMPs中的明胶酶类，其与局部内皮损伤，引导血小板活化，诱导炎症反应密切相关[12];细胞间黏附分子（Intercelluar Adhesion Molecule，ICAM）1使白细胞与内皮细胞间的黏附作用增强，并更容易穿过血管壁[13];实验表明淀粉样前体蛋白（Amyloid Precusor Protein，APP）与阿尔茨海默病的神经炎症有关[14];哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）在调节先天性免疫应答时有重要作用，雷帕霉素抑制mTOR后，通过增加核因子κB上调促炎症介质的生成，同时通过抑制信号转导及转录激活因子3（Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT3）减少抗炎细胞因子IL-10的释放[15-16]。

通过对生姜治疗炎症的靶点基因进行GO功能富集分析与KEGG富集分析发现，生姜对急性炎症反应、炎症反应的调节、炎症介质的产生、T细胞的激活、淋巴细胞迁移、神经炎症反应、白细胞介素-12的正向调节等炎症相关过程有密切的影响。KEGG富集分析发现，Th17细胞分化相关通路存在显著富集，核因子κB信号通路也存在明显富集。Th17细胞分泌的IL-17是一种重要的炎症介质，它可以调控其他炎症介质如IL-6、TNF-α以及趋化因子如单核细胞趋化蛋白（Monocyte Chemoattractant Protein，MCP）-1、巨噬细胞炎症蛋白（Macrophage Inflammatory Protein，MIP）-2等的表达，来动员中性粒细胞，在炎症反应中发挥积极作用[17]。相关实验发现IL-17基因缺陷的小鼠更容易遭受肺部的细菌感染，其原因与中性粒细胞聚集减少相关[18]。核因子κB是细胞中的核转录因子，与很多疾病特别是慢性炎症性疾病的发生发展机制密切相关[19]。核因子κB不仅与B细胞发育和功能有关，还与T细胞、胸腺细胞、巨噬细胞的发育有关[20]。故生姜有效成分可通过调控Th17细胞分化信号通路和核因子κB信号通路来治疗炎症。

4 小结

最早用生姜炮制半夏解半夏毒记载于《刘涓子鬼遗方》，经过现代药理研究，姜制半夏炮制过程中加入的明矾对半夏毒针晶具有锈蚀、溶解作用，AlSO可以与不溶性草酸钙反应，从而使其锋利细长的针尖锈蚀、脱落、溶解，晶形结构破坏，从而失去刺激性的作用，证明了姜制半夏的炮制解毒作用[21]。另有研究发现生姜汁可使半夏对眼结膜刺激下降，对半夏的刺激反应呈现出较强的拮抗作用[22]。生姜汁冷浸半夏对小鼠腹腔刺激性与生半夏比较明显降低[23]。因此，即使不加入明矾炮制，生姜对半夏仍存在解毒作用。本研究正是经过分子对接计算，发现生姜所含成分与半夏毒针晶中的PTA具有较强的结合力，因此推论，生姜有效成分会对半夏毒性成分产生抑制作用。

综上所述，生姜解半夏毒主要通过3个方面来实现，一是姜制半夏，炮制减毒;二是生姜对半夏毒性成分产生抑制作用，三是生姜可以减轻半夏所致的炎症反应。

参考文献

[1]王军.半夏毒性及炮制减毒研究[J].陕西中医，2010，31（9）：1229-1231.

[2]黄凤英，高健美，龚其海.半夏药理作用及其毒性研究进展[J].天然产物研究与开发，2020，32（10）：1773-1781.

[3]葛秀允.天南星科有毒中药刺激性毒性成分及矾制解毒共性机制研究[D].南京：南京中医药大学，2009.

[4]周信，张小荣，张秋燕，等.生半夏及其炮制品对小鼠主动脉内皮细胞炎性因子分泌的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：261-265.

[5]金羊平，吴皓，郁红礼，等.姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激性毒性的机制研究[J].中国中药杂志，2016，41（6）：1087-1092.

[6]高永.半夏凝集素结构分析与分子模拟研究[D].杭州：浙江理工大学，2015.

[7]段爱霞，陈晶，刘宏德，等.分子对接方法的应用与发展[J].分析科学学报，2009，25（4）：473-477.

[8]史闰均，吴皓，郁红礼，等.生姜解半夏毒的研究-生姜汁对半夏毒针晶所致炎性反应的影响[J].中药药理与临床，2010，26（4）：42-44.

[9]吴皓，舒武琴，邱鲁婴，等.生姜解半夏毒的实验研究[J].中药材，1998，21（3）：137-140.

[10]Zhang H，Liu L，Jiang C，et al.MMP9 protects against LPS-induced inflammation in osteoblasts[J].Innate Immun，2020，26（4）：259-269.

[11]Wan C，Yuan G，Yang J，et al.MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis[J].J Endod，2014，40（5）：658-664.

[12]黄琦，刘欧，刘小希，等.基质金属蛋白酶在主动脉瘤中的作用和分子机制研究[J].心肺血管病杂志，2018，37（11）：1023-1029.

[13]宋宜慧，黄熙.细胞间黏附分子-1与血管生成的研究进展[J].免疫学杂志，2012，28（6）：530-533.

[14]Zhang T，Yu J，Wang G，et al.Amyloid precursor protein binds with TNFRSF21 to induce neural inflammation in Alzheimer′s Disease[J].Eur J Pharm Sci，2021，157：105598.

[15]Weichhart T，Costantino G，Poglitsch M，et al.The TSC-mTOR signaling pathway regulates the innate inflammatory response[J].Immunity，2008，29（4）：565-577.

[16]陈洪菊，屈艺，母得志.mTOR信号通路的生物学功能[J].生命的化学，2010，30（4）：555-561.

[17]Kolls JK，Lindén A.Interleukin-17 family members and inflammation[J].Immunity，2004，21（4）：467-476.

[18]Ye P，Rodriguez FH，Kanaly S，et al.Requirement of interleukin 17 receptor signaling for lung CXC chemokine and granulocyte colony-stimulating factor expression，neutrophil recruitment，and host defense[J].J Exp Med，2001，194（4）：519-527.

[19]金晶，刘耕陶.NF-kB的研究进展[J].国外医学·药学分册，2000，27（3）：133-137.

[20]O′Neill LA，Kaltschmidt C.NF-kappa B：a crucial transcription factor for glial and neuronal cell function[J].Trends Neurosci，1997，20（6）：252-258.

[21]吴皓，钟凌云，李伟，等.半夏炮制解毒机制的研究[J].中国中药杂志，2007，32（14）：1402-1406.

[22]苏曼，陈军，高洁，等.生姜炮制成干姜前后挥发油透皮吸收促进作用的比较研究[J].中草药，2019，50（24）：5988-5994.

[23]崔美娜，钟凌云，张大永，等.中药半夏复制法炮制的研究进展[J].中国中药杂志，2020，45（6）：1304-1310.

（2021-03-29收稿 本文編辑：杨觉雄）

基金项目：山东省名老中医药专家传承工作室建设项目（鲁卫函〔2019〕67号）

作者简介：李浩然（1996.02—），男，硕士研究生在读，研究方向：中医药治疗神经系统疾病，E-mail：812050413@qq.com

通信作者：周嘉培（1995.11—），女，硕士研究生在读，研究方向：中医脾胃病的临床与研究，E-mail：zjpdyx95@163.com