韩晓乐，刘晨音，于 帆，朱佳骅，胡军成

(中南民族大学 化学与材料科学院，湖北 武汉 430074)

异喹啉生物碱盐酸小檗碱，又称黄连素,对多种革兰阳性及阴性菌具有抑制作用，能增强白细胞及肝网状内皮系统的吞噬能力，有较强的体内外抗肿瘤活性并能诱导B16细胞分化.小檗碱的盐酸盐已广泛用于治疗胃肠炎、细菌性痢疾等，对肺结核、猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道感染也有一定疗效，临床还发现本品有抗心律失常的作用[1].蛋白质错误折叠形成纤维状凝结物，是目前已知的多种退行性精神疾病，诸如阿尔兹海默症的发病原因.纤维化过程中产生大量毒素影响细胞和生物体的正常生理活性，并加速细胞的凋亡[2-3].

目前已有学者通过荧光技术、量热技术研究发现盐酸小檗碱可与牛血清白蛋白亚结构域中的氨基酸残基结合，在光谱分析手段下表现出对蛋白质内源荧光的规律性猝灭，白蛋白最大发射峰红移，对热力学参数进行计算得出猝灭机制为静态猝灭[4-6].但是，盐酸小檗碱对于蛋白质淀粉样纤维化的影响作用及其机制仍缺乏相关研究.因此，了解蛋白质淀粉样纤维化过程的产生机理，寻找抑制或减慢纤维化速度的方法或将为治疗相关疾病带来新的思路[7-8].

本文以牛血清白蛋白(BSA)为模型，采用荧光光谱(FL)、紫外可见光谱(UV)、圆二色谱(CD)进行分析表征，同时使用场发射电镜(SEM)观测蛋白形貌，研究了盐酸小檗碱对牛血清白蛋白淀粉样纤维化的抑制作用及抑制机制,以期在药代动力学、医学等领域为盐酸小檗碱的进一步开发使用提供理论基础[9-10].

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

F-7000型荧光光度计(日本，日立公司)，UV-2550型紫外可见分光光度计(日本，日立公司)，Chirascan Plus圆二色谱仪(日本，日立公司)；SU8010型场发射电镜，BSA (纯度≥98 %，BioFroxx公司)，盐酸小檗碱( BH，纯度≥98 %，上海西陇生物科技公司)，硫黄素T (ThT，纯度97 %，上海麦克林生物科技公司)，8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS，纯度96 %，上海阿拉丁有限公司).BH用5 %无水乙醇溶解，配制成浓度为1.0×10-3mol·L-1的原始溶液，于4 ℃ 冰箱中避光保存；其它试剂均为分析纯.实验用水为超纯水.

1.2 实验方法

1.2.1 BSA淀粉样纤维化的制备

称取适量的BSA溶解于pH=7.4的PBS缓冲溶液(0.05 mol·L-1) 中，配制成物质的量浓度为150.0 μmol·L-1的蛋白溶液，放置在4 ℃ 的冰箱中充分溶解12 h.取不同体积的盐酸小檗碱原液加入到BSA蛋白溶液中，盐酸小檗碱的物质的量浓度分别为0、37.5、112.5、150.0 μmol·L-1.将上述溶液充分混匀后, 置于65 ℃ 的恒温水浴锅中培育，分别在1、2、3、9、12、24、36、48、60、72、96 h 时取样，样品保存于-20 ℃ 冰箱中待测.

1.2.2 ThT荧光光谱测定

称取适量的ThT溶解于pH=7.4的PBS缓冲溶液中，配制成物质的量浓度为50.0 μmol·L-1的荧光试剂，向2 mL的ThT试剂中加入20 μL不同时间段取出的BSA样品，充分振荡，避光反应30 min.使用荧光分光光度计，在440 nm 的激发波长下，测定450～650 nm 范围内的荧光光谱，激发和发射的狭缝宽度均为5 nm.

1.2.3 ANS荧光光谱测定

称取适量ANS溶解于pH=7.4的PBS缓冲溶液中，配制成物质的量浓度为150.0 μmol·L-1的荧光试剂，向2 mL ANS溶液中加入50 μL不同时间段取出的BSA样品，充分振荡，避光反应30 min 后测定ANS荧光光谱.激发波长设定为380 nm，扫描范围为400～600 nm，激发和发射的狭缝宽度均为2.5 nm.

1.2.4 CD测定

使用圆二色谱仪(CD)测定BSA溶液培育前后二级结构的变化.在室温条件下，将稀释的蛋白溶液(3.75 μmol·L-1) 加入到石英比色皿中进行测定，波长扫描范围为190～250 nm ，每组样品测量3次，通过扣除缓冲溶液的背景光谱来校正所测得的CD光谱[6,9,11-12].

2 结果与讨论

2.1 盐酸小檗碱对牛血清白蛋白淀粉样纤维化的抑制

硫黄素T是一种阴离子荧光试剂，对纤维的灵敏度和特异性识别度很高，对纤维有稳定的亲和性，能与β-折叠表面的芳香族氨基酸发生特异性结合，于440 nm的激发波长作用下，在484 nm 处出现特征发射峰，β-折叠含量越多荧光强度越强，可以此间接反应纤维化的程度[2,13].BSA与人血清白蛋白(HSA)为同源蛋白，不同于大多数蛋白质的核依赖聚集模型，BSA和HAS在纤维化培育开始后便形成原纤维，进而结合形成成熟的淀粉样纤维.由ThT荧光图谱(图1)可看出，在0～60 h,蛋白质纤维处于生长期，60 h 以后，荧光强度趋于稳定，说明溶液中原纤维基本都已形成成熟的淀粉样纤维，且随着蛋白质中BH浓度的增大，ThT荧光强度呈现减弱的趋势，因此可以初步判断，盐酸小檗碱对牛血清白蛋白的淀粉样纤维化有抑制作用，并与物质的量浓度成正相关.

图1 不同浓度盐酸小檗碱存在下BSA淀粉样蛋白聚集的ThT荧光动力学

2.2 盐酸小檗碱对牛血清白蛋白淀粉样纤维表面疏水性的影响

蛋白质在不断聚集形成纤维化的过程中，常伴随着蛋白质结构的折叠，诱导蛋白质内部疏水性氨基酸暴露.ANS作为一种典型的疏水性探针，本身荧光强度较弱，当其作用于蛋白质的疏水性氨基酸时，其荧光强度会显著增强[10,14].常温下BSA内部疏水性氨基酸不会暴露出来，但在65 ℃ 培育96 h 后，BSA-ANS体系表现出较强的荧光强度.表明纤维化培育后的BSA表面暴露出较多的疏水性氨基酸残基.图2显示，当在蛋白质溶液中分别加入37.5、112.5、150.0 μmol·L-1的盐酸小檗碱后，ANS荧光强度随之降低，该结果表明盐酸小檗碱可以诱导BSA多肽链的收缩，从而使蛋白质在较高温度(65 ℃)下也能维持正常的结构稳定性.有文献报道，小分子与蛋白质的非共价结合能够稳定淀粉样纤维蛋白的核心结构，因此，推测盐酸小檗碱可能与BSA的氨基酸残基发生非共价结合而抑制了BSA纤维的形成[15].

图2 不同物质的量浓度盐酸小檗碱存在下BSA淀粉样蛋白聚集的ANS荧光动力学

2.3 盐酸小檗碱对牛血清白蛋白二级结构的影响

在正常蛋白质向成熟淀粉样纤维转化的过程中，蛋白质二级结构中的α-螺旋会向β-折叠转变[16].图3显示未经培育的BSA在208和222 nm 处有2个明显的特征吸收峰，表明在BSA结构中α-螺旋占主导地位.当BSA在65 ℃下培育96 h 后，222 nm 处的吸收峰强度减弱，表明BSA的二级结构由α-螺旋向β-折叠转变[16].当向上述培育的BSA溶液中加入不同物质的量浓度的盐酸小檗碱后，BSA的CD光谱椭圆度逐渐恢复，且呈现浓度依赖关系，表明盐酸小檗碱的加入能够阻止蛋白质二级结构由α-螺旋向β-折叠的转变，BH通过稳定蛋白质的α-螺旋结构而发挥其抑制淀粉样纤维化的作用[10].

图3 不同浓度盐酸小檗碱存在下65 ℃ 水浴培育96 h后BSA二级结构的变化

2.4 SEM测定

图4为不同物质的量浓度(cA=0 μmol·L-1,cB=37.5 μmol·L-1,cC=112.5 μmol·L-1,cD=150.0 μmol·L-1)BH含量培育96 h后，蛋白质在扫描电子显微镜下的形态.可看出随着BH物质的量浓度的增大，蛋白质的纤维化程度逐渐减小，纤维边缘逐渐模糊，佐证前期实验中BH对蛋白质的纤维化呈现抑制作用.

图4 不同物质的量浓度盐酸小檗碱存在下65 ℃ 水浴培育96 h后BSA在扫描电镜下的形貌

3 结论

盐酸小檗碱对BSA淀粉样纤维化的抑制作用呈现浓度依赖性，BH通过减少蛋白质表面疏水性氨基酸的暴露，使得蛋白质在较高温度(65 ℃)下也能够维持正常的构象.BH可能通过与BSA中的赖氨酸残基的特异性结合而稳定蛋白质结构，从而抑制蛋白质的纤维化聚集.该研究结果可为盐酸小檗碱作为新型抗淀粉样蛋白抑制剂的研发提供一定的理论基础.