彭 龙，苗书魁，陆桂丽，汪 萍，夏 俊，米晓云，魏 婕，魏玉荣，沙依兰·卡依扎，马文戈*

（1.新疆农业大学动物医学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所＆新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，乌鲁木齐 830013）

犊牛腹泻是牛场常见疾病，该病的高发病率与高死亡率是养牛业发展的重大阻碍[1，2]。 发病犊牛的临床症状表现为体温升高、食欲废绝、精神不佳、粪便恶臭稀软，常伴有不同程度脱水等[3，4]。造成犊牛腹泻的原因较为复杂，通常为混合感染，防控难度增加。 常见的病原感染有冠状病毒、轮状病毒、病毒性腹泻病毒、致病性大肠埃希氏杆菌等。其中冠状病毒既可以感染呼吸道，也可以感染肠道，常导致犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道疾病，携带病毒的牛长期带毒，病毒颗粒随着粪便排出体外后仍具有感染性。由于新疆的天气冬季较长适合病毒存活，所以牛群易发生大范围的感染。 致病性大肠埃希氏杆菌是引起多种严重疾病的主要致病菌，该菌借助食物、水源等传播途径进行传播。 研究表明，与人类疾病相关的致病性大肠埃希氏杆菌在不少动物的粪便中被检测到，严重威胁人类与动物的健康[5～8]。喀什地区某牛场发生犊牛腹泻，通过临床检查并做流行病学调查后，初步怀疑犊牛死亡的原因为病毒或细菌感染所致。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

采集病死犊牛的新鲜粪便共8 份，健康犊牛粪便2 份，4 ℃冰盒保存，尽快转移到实验室进行后续检测。

1.1.2 试剂

RNA/DNA 提取纯化试剂盒、DNA 胶回收试剂盒（宝日医生物技术有限公司），LB 固体培养基、麦康凯琼脂（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.1.3 仪器和设备

电泳仪（北京六一仪器厂）， 移液器（伊孚森生物技术），-70 ℃冰箱（VX480E， 海尔），RT-PCR 仪（Eppendorf 公司），超净工作台（BBS-SDC，山东博科仪器制造有限公司），低温台式高速离心机（4K15，德国Sigma 公司）， 电子秤 （LT102E， 白鳍豚生物科技有限公司）， 凝胶成像仪 （AB 75342 Uppsala，GE Healthcare Sweden）。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离

将采集的新鲜粪便样品在超净工作台中分别接种于LB 琼脂培养基、麦康凯（MAC）鉴定培养基以及SS 琼脂培养基上，将恒温箱调至37 ℃，有氧条件下培养10 h 左右，观察培养基上菌落情况。 次日将LB琼脂培养基上的不同颜色、大小、形状的单菌落共30 个，挑取、接种至5 mL LB 液体培养基中后，置于37 ℃恒温摇床中12 h 左右培养。 将纯化后的细菌通过使用细菌16SrDNA 的通用引物(上游引物：5’－AGAGAATGATCTCGGCTCAC－3’;下游引物：5’－GGAAACCTTGTTGCAACTT－3’），采用PCR 技术对目的基因(预期片段长度约1 500 bp）进行扩增。 PCR 扩增体系50 μL:模板0.5 μL，上、下游引物各2 μL，2×Tag RT-PCR MasterMix25 μL，双蒸水补充至50 μL。 扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火时长15 s，72 ℃延伸1.5 min，共25 个循环，72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。 扩增产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.2 药物敏感性实验

选取四环素、头孢曲松、阿奇霉素、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、头孢他啶、卡那霉素、链霉素、左氧氟沙星、洛美沙星、诺氟沙星和青霉素药敏纸片对分离到的细菌进行药物敏感性实验[9，10]。

1.2.3 病毒RT-PCR 检测

1.2.3.1 样品处理 将采集的粪便样品与1×PBS 按照1:2 的比例混合，-20 °C 冻融3 次,6 000 r/min 离心8 min 后取上清，通过RNA/DNA 提取纯化试剂盒提取病原RNA。

1.2.3.2 病毒RT-RT-PCR 检测 BcoV -S 基因引物序列（上游引物:5'-GAATTCTTTCAGATACTTTTAAT GTCCTTA-3',下游引物5'-AAACTCAGCAGATTACCATTAGAACGATAT-3'）,扩增长度1 309 bp。 牛轮状病毒的引物序列（上游引物：5'-AGAATAATCGTTCTACTA -3',下游引物：5'-CGGTCACATATCGTAACTCT-3'），扩增长度786 bp。牛病毒性腹泻病毒的引物序列（上游引物：5'-GCTAGCCATCGATAGAG-3',下游引物：5'-TGGATGTGCCATCGTAAGC-3'），扩增长度925 bp。 上述引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 反转录RT-PCR 的反应体系如下：2X Buffer 12.5 μL，prime script Mix 1.5 μL 上游引物、下游引物各1.25 μL(引物浓度20 μ mol/L)，RNA 模板4 μL，双蒸水4.5 μL，总反应体系为25 μL。用无菌枪头将上述溶液充分混匀，RT-PCR 反应体系：50 ℃30 min，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火时长15 s，72 ℃延伸1.5 min，共30 个循环，72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。 RT-PCR 的扩增产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3.3 扩增产物序列测定与分析 按照DNA 胶回收试剂盒说明书胶回收目的基因, 回收产物与pMD19-T 载体在16 ℃条件下连接16 h，转化至Top-10 感受态细胞中,在无菌条件下涂板培养14 h 后，挑取形态大小合适的单菌落至5 mL 液体培养基，37 °C 摇床过夜培养，次日提取质粒。 质粒经快速酶切，初步筛选出阳性质粒，并将阳性质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。 将测序结果在NCBI BLAST 搜索同源序列。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养鉴定结果

2.1.1 分离细菌形态学观察及RT-PCR 鉴定结果

在采集到的8 份新鲜腹泻粪便样品中均分离出细菌，在麦康凯琼脂培养基上发现红色和黄色表面光滑、湿润的菌落；在LB 琼脂培养基上发现大小、形态不同的灰白色菌落；在SS 培养基上无菌落，将颜色、大小、形态不同的菌落。通过16SrDNA 扩增目的基因条带并测序发现双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希氏杆菌、肠球菌、酪酸梭菌、放线菌共6 种细菌。在分离的大肠埃希氏杆菌中，经测序鉴定有8 株为致病性大肠埃希氏杆菌，均扩增出约1 500 bp 大小的条带（见图1）。

图1 大肠埃希氏杆菌RT-PCR 检测结果

2.1.2 药敏试验结果

由表1 可见致病性大肠埃希氏杆菌对阿奇霉素、美罗培南、阿米卡星这三种药物高度敏感，对其余十种抗生素耐药，出现该种情况与该牛群长期使用抗生素有关。 阿奇霉素、美罗培南、阿米卡星这三种敏感药物可作为继发感染的首选治疗药物。

2.2 病原核酸检测结果

BVDV 及BRV 的RT-PCR 检测结果均为阴性(图2，图3)，未检测到BVDV 是由于该牛场已免疫过BVDV 疫苗或样品数量太少，而没有检测到BRV 可能与样品数量太少有关。 BCoV 的RT-PCR 检测结果为阳性，通过琼脂糖凝胶电泳结果分析基因条带与预期的大小一致，约为1 300 bp（图4）。 将目的基因连接转化后，提取质粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。 将测序结果在NCBI 上进行分析，结果显示与BCoV 的同源性均在96%以上，因此可确定该毒株为牛冠状病毒。

图2 BVDV RT-PCR 检测结果

图3 BRV RT-PCR 检测结果

图4 BCoV RT-PCR 检测结果

3 讨 论

本实验采集了喀什地区某养殖场发生腹泻的粪便样本，经细菌分离培养与鉴定，并对引起犊牛腹泻的常见病毒进行RT-PCR 检测，结果显示BCoV 为阳性。 BCoV 阳性率为75%，致病性大肠埃希氏杆菌阳性率为100%，同时感染BCoV 和致病性大肠埃希氏杆菌的犊牛阳性率为75%。 试验结果表明，该牛场犊牛腹泻由BCoV 和致病性大肠埃希氏杆菌引起。 在实地观察发现该牛场的饲养管理方式存在不足，消毒不彻底，并且牛圈空间狭小不利于通风，所以容易导致病原的滋生。 药物敏感性实验表明，该牛场的致病性大肠埃希氏杆菌存在多重耐药情况。原因可能是该牛场抗菌药长期使用所致[11～13]，或部分牛在引进该牛场之前使用过大量抗生素。

将感染牛冠状病毒的牛进行隔离，同时加强并完善牛场的饲养管理，定期对牛圈及饲养环境消毒，保证牛在通风、干燥、清洁卫生的饲养环境中生长。另外，对哺乳母牛乳头彻底消毒干净，防止致病微生物传给犊牛。犊牛出生后及早哺喂初乳，最好在产后1 h 之内给犊牛喂初乳，奶温在36 °C～38 °C。致病性大肠埃希氏杆菌是导致犊牛腹泻的主要致病菌之一，犊牛出生后7 d，按规定注射大肠杆菌疫苗，也可适当使用敏感抗生素进行预防治疗[14]。

4 结 论

本实验通过细菌分离培养鉴定、药物敏感性实验和相关病毒RT-PCR 检测，确诊该牛场本次犊牛腹泻的主要原因是牛冠状病毒与致病性大肠埃希氏杆菌混合感染引起。 由于BCoV 目前国内没有疫苗，且无特效药，牛感染BCoV 后，常会引起致病性大肠埃希氏杆菌的继发感染，本实验药敏结果显示，致病性大肠埃希氏杆菌对阿奇霉素、美罗培南、阿米卡星敏感，因此可以将其作为致病性大肠杆菌病的治疗药物。