人ATP11A和ATP11B克隆、表达及鉴定

2022-05-16韩甜甜李晓莹潘凌亚

基础医学与临床 2022年5期

韩甜甜，曾靖，尹婕，李晓莹，金滢，李艳，潘凌亚

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院妇产科国家妇产疾病临床研究中心，北京 100730)

卵巢癌(ovarian cancer)是妇科恶性肿瘤首位的致死病因，目前治疗手段仍为在肿瘤细胞减灭术的基础上辅助化疗。但其易产生化疗耐药，从而导致高复发率和低生存率[1]。近年来，肿瘤干细胞的耐药机制探索对改善卵巢癌预后具有重要作用。本课题组通过分离验证侧群细胞的干细胞样特性，并进一步由蛋白组学筛选出卵巢癌细胞系侧群细胞中细胞周期蛋白50A(cell cycle protein 50A, CDC50A)显著上调[2]。查阅文献发现P4型磷脂转移酶(type Ⅳ-P-type phospholipid transferases,P4-ATPases)与卵巢癌的顺铂耐药性有关[3]，而其功能的实现主要是与CDC50A形成膜蛋白转运体[4]。为后续探索P4-ATPases在卵巢癌中作用机制，获得其表达质粒是实验的先决条件。

P4-ATPases仅存在于真核生物中，可通过磷脂内翻的调节来维持细胞膜磷脂不对称分布，其中ATP11A和ATP11B是研究较多的两个P4-ATPases亚型，均为十级跨膜大分子膜蛋白，其蛋白编码序列(coding sequences, CDS)区全长分别为3 405 bp和3 534 bp，难以一次性完成全长克隆，并且克隆时容易出现片段缺失、错配等问题[5]。本研究采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术[6]获取了ATP11A和ATP11B蛋白质编码区cDNA序列，通过单一位点的限制性内切酶对其进行分片段扩增、拼接构建，摸索针对ATP11A和ATP11B扩增方案，构建高保真、稳定表达的重组质粒。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人胚胎肾上皮细胞系293(HEK-293T)由原清华大学医学院癌症与干细胞中心郭伟教授赠予，培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2细胞孵箱中。

1.1.2 引物：从HUGO基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)数据库中检索获取ATP11A(GENE ID：23250)、ATP11B(GENE ID：23200)序列，选择最长的mRNA变异体序列(分别为NM_015205.2和NM_014616.2)作为克隆模板(自Kozak序列至终止密码子)，通过内切酶位点预测在线网站www.restrictionmapper.org确定ATP11ACDS内单一酶切位点(XhoⅠ酶切位点)，将其分为2个片段，通过Primer3web (https://bioinfo.ut.ee/primer3/)分别对两个片段设计引物。引物1正向引物(forward primer，F)在5′端引入EcoRⅠ酶切位点5′-GCGgaattcGCCACCATGGACTGCAG CCTC，反向引物(reverse primer，R)为CDS区单一XhoⅠ酶切位点：5′-TctcgagGCTTCATTAT CAG。然后通过引物2(F：5′-TAATGAAGCctcg agAAGAC，R:5′-TGGACACCTT CTCCTTCCAG)将片段2序列进行扩增，再通过引物3(F：5′-TAATGAAGCctcgagAAGAC，R：5′-ATGAGTT TCTGCTCGCCGGGGCCGAAACTCAGGCTGCTGGAAG)在片段2的3′端引入标签基因myc，最后通过引物4(F：5′-TAATGAAGCctcgagAAGAC，R：5′-TACgcggccgcTCACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCG CCG)在myc远端引入NotⅠ酶切位点。从而完成了ATP11A的引物设计。同法，选择ATP11BCDS区缺失的酶切位点，在正向引物中加入XhoⅠ酶切位点5′-GGCctcgagGCCACCATGTGGCGCTGGATCC，在反向引物中先后加入HA标签基因和NotI酶切位点：5′-CTAgcggccgcTTACGCATAGTCAGGAACATCG TATGGGTAGCCGGGGCCACAA GTAGATGAGTC。所有引物设计后通过美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)在线网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)检验其特异性。以上引物均由北京博迈德科技发展有限公司合成。

1.1.3 其他：EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ酶(MBI公司)；DNA转染介质(PolyJetTMSignaGen公司)；PrimeSTAR HS DNA Polymerase、dNTPs(TaKaRa公司)；T4DNA连接酶(Promega公司)；克隆载体(EZ-TTMcloning vector)T载体快速链接试剂盒(GenStar公司)；CHAPS(翌圣生物公司)；鼠抗β-actin单克隆抗体(Abcam公司)；鼠抗myc-tag单克隆抗体、鼠抗HA-tag单克隆抗体(北京华兴博创基因技术有限公司)；兔抗鼠HRP标记二抗(南京赛泓瑞生物科技公司)；DMEM细胞培养基(Gibco公司)。质粒pLVX-IRES-mCherry和pLVX-IRES-RFP、大肠杆菌菌株DH5α/TOP10(原清华大学医学院癌症与干细胞中心郭伟教授赠予)。

1.2 方法

1.2.1ATP11A、ATP11B克隆及表达质粒构建：ATP11A的片段1(ATP11A1)、片段2(ATP11A2)和ATP11B扩增条件分别为：95 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，30个循环后72 ℃延伸5 min；95 ℃预变性3 min，98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30个循环后72 ℃延伸5 min；94 ℃ 预变性3 min，98 ℃变性10 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，32个循环后72 ℃延伸5 min。

琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的基因。将DNA与EZ-T克隆载体相连接，提取质粒并酶切鉴定，DNA测序，选取正确序列DNA片段。分别用对应的双酶切表达载体和目的基因，用T4DNA连接酶连接、感受态大肠杆菌TOP10转化、单克隆扩增后，提取表达质粒，并经酶切鉴定。

1.2.2 表达质粒瞬时转染：将HEK-293T细胞接种于6孔培养板中，待细胞汇合度为90%时，将转染混合液pLVX-ATP11A-mCherry或pLVX-ATP11B-RFP(1 μg/孔)、DNA转染介质(3 μL/孔)均匀放入HEK-293T培养基中。以未转染细胞为空白对照组、转染空载质粒为阴性对照组。48 h后完成目的质粒瞬时转染。

1.2.3 免疫荧光检测荧光蛋白表达：将6孔板放置在荧光显微镜下，观察各组的细胞状态及红色荧光激发比例。用含有1%胎牛血清的PBS重悬瞬转空载质粒及目的基因质粒的细胞，形成细胞浓度为1×106个/100 μL的单细胞悬液。以未转染质粒的HEK-293T作为同型对照。使用流式细胞仪检测荧光：分别以最大吸光波长587 nm或532 nm、最大反射波长610 nm或588 nm定量pLVX-ATP11A-mCherry或pLVX-ATP11B-RFP的转染效率。

1.2.4 免疫印迹法检测标签蛋白表达：CHAPS裂解细胞并提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量。经常温变性、SDS-PAGE分离，在4 ℃ 30 V条件下浸泡10%甲醛溶液24 h，转移至聚偏氟乙烯膜上，分别加入鼠抗人myc抗体(1∶5 000)、鼠抗HA抗体(1∶5 000)后在4 ℃条件下过夜孵育，次日常温孵育兔抗鼠HRP标记二抗(1∶5 000)，增强型化学发光试剂(ECL)避光显色。ATP11A共有1 134个氨基酸(129.8 ku)，ATP11B共有1 177个氨基酸(134.2 ku)。

2 结果

2.1 ATP11A和ATP11B的克隆、鉴定

对ATP11A的两个片段及ATP11B扩增产物进行琼脂凝胶电泳，可得到单一条带，大小分别约2 301 bp(ATP11A1)、1 103 bp(ATP11A2)、3 788 bp(ATP11B)(图1)。这3个扩增片段的克隆载体(ATP11A1-EZT，ATP11A2-EZT，ATP11B-EZT)分别经凝胶电泳和酶切鉴定，大小与预期相符(图2)。

2.2 ATP11A、ATP11B表达载体的构建

经琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定可见pLVX-ATP11A-mCherry、pLVX-ATP11B-RFP表达载体构建完成(图3～5)。

2.3 ATP11A、ATP11B表达验证

pLVX-ATP11A-mCherry的转染效率为38.9%，阴性对照组的转染效率为74.7%。pLVX-ATP11B-RFP的转染效率为41.9%，阴性对照组则为48.7%(图6)。阳性对照组可测得标签蛋白的表达，而阴性对照组、空白对照组则无表达，说明目的基因在蛋白水平可特异性表达(图7)。

图1 ATP11A1、ATP11A2、ATP11B扩增产物的0.8%琼脂糖电泳结果Fig 1 0.8% agarose electrophoresis results of ATP11A1, ATP11A2, ATP11B amplification

A.cloning vector of ATP11A1-EZT; B.identification of ATP11A1-EZT by EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ; C.cloning vector of ATP11A2-EZT; D.identification of ATP11A2-EZT by Xho Ⅰ and Not Ⅰ; E.cloning vector of ATP11B-EZT and identification by EcoR Ⅰ

3 讨论

本课题组研究发现卵巢癌侧群细胞的干细胞样特性，并从蛋白组学角度出发，寻找潜在的致病膜蛋白。由于细胞表面跨膜蛋白具有信号传导、细胞黏附、物质运输等重要的生理功能，故锁定跨膜蛋白家族，而与其关联密切的是P4-ATPases[2-5]。如何获取其编码基因是保证后续实验的可行性、可靠性的基础。

目前多项研究表明，多种P4-ATPases是重要的生物功能蛋白，参与完成功能蛋白转运[7]。其中，位于胞膜、细胞质内的早期内吞小体上的ATP11A和ATP11B维持细胞膜脂质双分子层的不对称性，参与细胞凋亡、物质分泌、有丝分裂、宿主-病毒交联等生理病理过程。ATP11A可维持磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine,PS)分布在细胞膜内侧，胞膜外侧PS有序的暴露可促使血小板凝固、细胞凋亡和肌纤维融合等生理行为[7-9]。除了参与重要的生理功能，ATP11A还参与多种疾病的发生发展：ATP11A

A.expressing plasmids of pLVX-ATP11A1-mCherry; B.identification of pLVX-ATP11A1-mCherry by EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ; C.expressing plasmids of pLVX-ATP11A-mCherry; D.identification of pLVX-ATP11A-mCherry by Xho Ⅰ and NotⅠ; E.identification of pLVX-ATP11A-mCherry by EcoR Ⅰ and NotⅠ

在转移性直肠癌中高表达，使得患者无进展生存期显著缩短[10]，此外，先天性肺纤维化与ATP11A的突变也具有强相关性[11]。除了实体瘤ATP11A还可通过RAS通路促进淋巴瘤的耐药性，当上调ATP11A的表达可使Bcr/Abl阳性的恶性淋巴细胞白血病对法尼基转移酶抑制剂产生耐药[12]。ATP11B可通过促进分泌型囊泡对顺铂的转运，使得胞内顺铂的排出能力增强，从而促进卵巢癌对顺铂的耐药性[3]。可见ATP11A、ATP11B可能是肿瘤耐药的潜在靶基因。目前尚无对ATP11A在卵巢癌中的研究，也缺乏对ATP11B在卵巢癌耐药机制的深入探讨。本研究构建了ATP11A、ATP11B克隆和表达载体，其中引物设计是核心，涉及了对表达载体构建的整体思路，最终可上调蛋白的特异性表达，为后续的研究提供了有效的工具。

本文局限于只构建了表达载体，没有功能学实验的探讨，但作为前期实验，克服了编码大分子蛋白目的基因的克隆难点，为后续卵巢癌机制的研究提供了重要的工具。