张泽宇，王 鑫，李丽君，马健生

中国地质调查局沈阳地质调查中心，辽宁 沈阳 110032

0 序言

中国是抗生素生产及使用大国，无论是在城市医疗卫生领域还是乡镇农村的畜牧兽医方面抗生素的使用已较为普遍. 中国每年的抗生素消耗量约占到全球消耗量的50%［1］. 抗生素在生产和使用过程中或直接散入环境载体，如水、土壤中，或随着人体及动物的代谢物进入到环境载体中. 近些年研究表明，国内外环境样品，如土壤、地表水、地下水等中均检出了不同种类的抗生素［2-7］. 目前对抗生素在环境载体中的检测主要集中在江河湖泊、城市污水处理厂排污口等地表水系统，而地下水中抗生素的检测报道相对较少，主要是由于地下水具有一定的自净功能，抗生素在通过地表水和土壤等环境载体进入到地下水中时其浓度会降低. 然而，长期低浓度抗生素水平的维持也会对地下水中的微生物种群生态造成失衡，长期饮用含有抗生素的水源对于人体免疫系统会造成严重的损害. 中国是一个淡水资源相对匮乏的国家，城镇和农村约有7成以上的人饮用地下水［8］. 部分地区由于过度开采使用地下水，形成漏斗区，造成地下水资源严重紧缺和污染的问题日益严重［9］. 因此对于地下水中的抗生素污染的关注尤为迫切.

目前对于水中的抗生素的检测的方法主要有：免疫微生物法、固相萃取－液相色谱法（SPE－HPLC）、固相萃取－液相色谱三重串联质谱法（SPE－UPLC－MS/MS）［10］.SPE－UPLC－MS/MS 法可以提供较低的检出限和较为明确的定性分析检测，是目前普遍应用的检测方法.然而，SPE－UPLC－MS/MS 法在实验室内富集样品500～1000 mL 水，一般采用的上样流速为5～6 mL/min，富集一个样品需要2～4 h，耗时较长且不易同时处理大批量样品，检测效率较低，不适用于水质抗生素污染的大面积生态调查项目［11-13］. 薄膜梯度扩散法（diffusive gradients in thin films，DGT）采样技术是基于Fick 第一扩散定律，即20 世纪90 年代开始发展的一项原位被动富集采样技术［14-15］. 该采样技术初期主要用于水体及土壤中进行无机金属元素的原位富集分析［16-18］，随着材料科学的进步，其应用到水体及土壤中有机污染物的采样分析中. Chen C E 等［19］利用DGT 法富集测定了英国一处污水处理厂中进水口及出水口中的40 种抗生素含量，采用主动采样方式共检出了14 种抗生素. 采用DGT 采样方式放置7 d 以内检出了14种抗生素中的10 种，放置超过10 d 后检出了全部14 种抗生素. 结果表明：DGT 法在日常监测污染水域中的抗生素含量是切实可行的；Chen W 等［20］利用DGT被动采样技术在水中原位监测了家庭及个人用护理产品及药物的含量.

本研究应用DGT－UPLC－MS/MS 法测定地下水中抗生素含量，首先在实验室内模拟地下水环境优化放置DGT 的时间T，根据经验公式计算出低温度下的扩散系数D 值，并在野外试验区进行了实际采样应用试验.

1 材料与方法

1.1 实验仪器与材料

美国铂金埃尔（Perkin Elmer）Qsight220 超高效液相色谱－三重串联四级杆质谱仪UPLC－MS/MS；屈臣氏超纯水；中国Labtech Multivap－10 氮吹浓缩仪；中国KQ52OOE 超声波清洗器；英国梯度扩散薄膜采样器XAD LSNC：吸附膜厚度0.5 mm，扩散膜厚度0.8 mm，过滤膜采用聚醚砜PES 滤膜，DGT 采样器截面积3.14 cm2.

实验用试剂：甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯；氯化钠、盐酸均为分析纯. 标准试剂：16 种磺胺类混合标准品（甲醇介质，浓度为100 mg/L）：磺胺醋酰（SCT）、磺胺氯哒嗪（SCP）、磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDT）、磺胺邻二甲氧嘧啶（SDX）、磺胺甲嘧啶（SMR）、磺胺对甲氧嘧啶（SME）、磺胺二甲嘧啶（SDM）、磺胺甲噻二唑（SMT）、磺胺甲基异恶唑（SMZ）、磺胺甲氧哒嗪（SMD）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺苯吡唑（SPA）、磺胺吡啶（SPD）、磺胺噻唑（STZ）、磺胺二甲异恶唑（SIZ）；10 种抗生素纯品：奥比沙星（OBX）、恩诺沙星（EFX）、环丙沙星（CFX）、洛美沙星（LFX）、氧氟沙星（OFX）、诺佛沙星（NFX）、林可霉素（LIM）、四环素（TC）、土霉素（OTC）、强力霉素（DC）.

1.2 样品采集与富集

采样地点为哈尔滨主城区松花江南岸4 处国家级监测井，编号：H01、H02、H03、H04. 样点地下水位范围在3～20 m 之间，平均水温7 ℃，属于潜层水. 由于是采集水质样品，DGT 选用活塞式采样器. 将DGT 采样器安装在塑料固定器上，下端拴上铅坠，固定器端系上尼龙绳，垂直放入水井中，要确保采样器浸入水面100 cm 以下，记录采样点位相关参数信息，包括采样点位高程、放置时间、地下水温度、水位埋深. DGT 法吸附测定目标物浓度基于Fick 第一扩散定律，计算公式见式（1）. 在DGT 采样器选定不变的情况下，其相关定量参数A，Δg 为固定已知值，放置时间t 为起始放置至回收采样器时间的差值（采集时间），可见对于目标物质的富集吸附主要与目标物扩散系数及t 值相关.

式中，C 为样品中目标物的浓度值；D 为目标物的扩散系数；A 为膜采样器的接触面积；t 为采集时间；M 为吸附膜上累积的目标物质的量；Δg 为扩散膜和吸附膜的厚度之和.

1.3 抗生素提取

取下DGT 采样器用超纯水冲洗表面污渍后装入干净的塑料袋中放入4 ℃保温箱保存，运输到实验室待测. 将DGT 采样器上的吸附膜取出，放入到15 mL玻璃试管中加入5 mL 甲醇，超声提取20 min，用甲醇冲洗DGT 采样器重复上述过程. 将超声好的溶液用氮吹浓缩仪吹至近干后加入0.1%甲酸定容到1 mL，待上机检测.

1.4 分析条件

色谱条件——PE Qsight220 三重串连四级杆液相色谱质谱仪，PE Brownlee SPP C18 色谱柱（2.7 μm，2.1 mm×100 mm）. 流动相A：0.1%甲酸水溶液. B：乙腈溶液. 流速：0.3 mL/min. 进样体积：10 μL. 梯度洗脱程序：0～0.5 min，A 90%；0.5～5 min，A 88%；5～7.2 min，A 40%；7.2～9 min，A 10%；9～9.2 min，A 90%；9.2～12 min，A 90%.

质谱条件——正离子模式（ESI＋）扫描，反吹气：100 mL/min，雾化器：180 mL/min，HSID 温度：300 ℃，离子源温度：400 ℃，喷雾电压：5000 V.

检测模式——多反应监测（MRM）扫描模式，优化得到26 种抗生素在正离子模式下质谱参数（见表1）.

2 结果与讨论

2.1 扩散系数（D）的确定

Chen C E 等［19］研究了室温25 ℃下不同抗生素在吸附膜为大孔吸附型树脂（XAD18）、扩散膜为葡聚糖凝胶树脂、膜厚度为0.8 mm 条件下扩散系数D25值. 根据Chen W 等［20］的研究，给出了当非一般室温条件下扩散系数（DT）与D25之间的经验关系公式，见式（2）. 此次采集地下水温度在5～7 ℃，由此方程式计算出7 ℃水温条件下中不同抗生素的扩散系数D7值，见表2. 低温状态下分子运动能量降低，扩散系数普遍降低.

表2 26 种抗生素在地下水中的扩散系数Table 2 Diffusion coefficients of 26 antibiotics in groundwater

式中，DT是当温度为T 时的扩散系数.

2.2 采样时间（t）的确定

在实验室内模拟地下水环境进行采样放置最优时间t 研究，取体积为10 L 塑料桶8 个分别加满水，加入氯化钠使烧杯中NaCl 浓度为0.01%，调节pH 在6.8～7.2 之间. 加入26 种抗生素混标100 ng，放入DGT 采样器，将塑料桶放入到冷藏柜中，冷藏柜设置温度为7 ℃，另做空白对照. 间隔3、7、10、14、20、25、30、35 d 分别取出DGT 采样器按照1.3 节步骤进行提取，1.4 节步骤上机检测，计算DGT 膜吸附量以质量记. 检测结果表明：大部分磺胺类抗生素在20～30 d出现吸附峰值，如SCP、STZ（图1b，图1c）；少部分磺胺类抗生素峰值出现在30～35 d 左右，如SCT（图1a）；喹诺酮类吸附峰值在30～35 d，如CFX 在35 d 达到吸附峰值（图1d）；LIM 吸附峰值在30～35 d 左右（如图1e）；四环素类OTC（如图1f）吸附峰值在30～35 d.

图1 抗生素的DGT 吸附量图Fig. 1 DGT adsorptive capacity of antibioticsa—磺胺醋酰（SCD）；b—磺胺氯哒嗪（SCP）；c—磺胺噻唑（STZ）；d—环丙沙星（CFX）；d—林可霉素（LIM）；f—四环素（OTC）

在野外选择井位H01 进行野外DGT 放置时间验证试验，选用XAD 型DGT 采样器9 组放置于井内，间隔3、7、10、14、20、25、30、35、40 d 分别取出DGT 采样器按照1.3 节步骤进行提取，1.4 节步骤上机检测，计算DGT 膜吸附量以质量记. 实际井位试验结果表明磺胺二甲嘧啶SDM（图2a）、磺胺噻唑STZ（图2b）均在30 d 内出现吸收量峰值，超过30 d 后由于凝胶溶胀和微生物降解等原因导致吸附效率下降，因此综合考虑野外原位富集地下水中抗生素DGT 放置时间在25～30 d 之间为宜.

图2 抗生素的DGT 吸附量图Fig. 2 DGT adsorptive capacity of antibioticsa—磺胺二甲嘧啶（SDM）；b—磺胺噻唑（STZ）

2.3 液相色谱－质谱条件优化

DGT 提取选用甲醇超声提取，样品定容溶剂选用纯水、纯甲醇、0.1%甲酸水溶液做比对，结果表明：选用0.1%甲酸可以有效减少液相色谱溶剂效应，分离度较好；流动相选用A 甲酸0.1%、B 乙腈，可以达到26种抗生素很好的液相色谱分离度；在26 种抗生素的多反应监测（MRM）总离子流（TIC）图（图3）中可以看出：26 种抗生素保留时间在2.0～10 min. 各抗生素保留时间见表1.

图3 26 种抗生素TIC 图Fig. 3 TIC of 26 antibiotics

2.4 线性范围、检出限、精密度和准确度

标准溶液配置：吸取1 mL 的16 种磺胺类抗生素标准原液到100 mL 容量瓶中，之后再分别加入0.1 mg的奥比沙星、环丙沙星、恩诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星、诺佛沙星、林可霉素、四环素、土霉素、强力霉素. 用甲醇定容到100 mL 容量瓶中，配制成浓度为1.0 mg/L的26 种抗生素混标一级储备液，用0.1%的甲酸溶液逐级稀释1.0 mg/L 抗生素混合标准母液，分别配制成浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10、20、50、100 μg/L 的标准工作液. 26 种抗生素以峰面积值x，对应的浓度值y，建立线性方程. 线性关系良好，R2＞0.995. 线性回归方程及相关系数见表3.

表3 26 种抗生素的线性方程及相关系数Table 3 Linear equations and correlation coefficients of 26 antibiotics

检出限：当进样浓度为10 ng/L，进样体积为10 μL时，根据串联质谱信噪比S/N 确定26 种抗生素的仪器检出限为3 倍的信噪比（3 S/N），其范围为0.002～0.074 ng/L，仪器定量限10 倍信噪比（10 S/N）的范围为0.007～0.248 ng/L.

精密度：取1000 mL 纯水加入到棕色玻璃瓶中，按照2.2 节加入NaCl，调节盐度和pH 值后放入DGT采样器，加入26 种抗生素标准10 ng，采集30 d 后上机检测，同时做7 组平行样品和空白对照，计算标准偏差和相对标准偏差（RSD），26 种抗生素的RSD 范围为4.45%～10.84%.

准确度：在纯水中添加三种浓度分别为10、50、100 ng 的26 种抗生素，每个浓度级别做6 组，计算各添加量的加标回收率. 26 种抗生素平均回收率范围在47.7%～94.6%之间. 检出限、精密度及准确度见表4.

表4 26 种抗生素检出限、精密度及准确度Table 4 Detection limit，precision and accuracy of 26 antibiotics

2.5 实际样品测试

实验选用的样品采自哈尔滨市北部松花江沿岸地区的4 口国家级地下水监测井. 样品经过原位富集采样放置30 d 后，经DGT－UPLC－MS/MS 测定后，共检出了8 种抗生素，结果见表5. 磺胺类、喹诺酮类、林可酰胺类抗生素均有不同程度检出，表明原位富集采样及液质检出方法在地下水中抗生素检测分析实际应用中可行.

表5 哈尔滨地区地下水中抗生素检出结果表Table 5 Detected antibiotics in groundwater of Harbin area

3 结论

本研究利用薄膜梯度扩散（DGT）这种原位被动采样技术实现了对地下水样品中多种抗生素的原位富集采样，相较于传统使用的固相萃取（SPE）提取技术，DGT 法具有耗时短，提取操作流程简便等优点，适用于区域性大面积地下水抗生素污染调查等样品量较多的项目采样及分析测试工作. 同时利用三重串联四级杆液相色谱质谱仪（UPLC－MS/MS）建立了测定水质中26 种抗生素的快速检测方法，可以实现水质中多种抗生素，包括磺胺类、喹诺酮类、林可酰胺类等的快速准确的定性定量分析. 利用本研究建立的采样及分析方法（DGT－UPLC－MS/MS）对哈尔滨地区进行实际采样分析试验，结果表明：在选取的4 个点位中均不同程度检出了抗生素. 此方法对于哈尔滨地区及松嫩平原地下水中抗生素污染的调查及生态风险评价可提供技术支撑.