葛鑫会，孟继坤，张 楠，苗雨欣，张秀清

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100089）

食用菌具有较高的营养价值，是多酚、多糖、蛋白质等活性物质的良好来源，由于其多酚类化合物具有较高的抗氧化、抗肿瘤、抗炎等生物活性[1-2]，近年来受到人们的广泛关注。五台山位于山西省东北部忻州市，其海拔高、地温低且土质肥沃、富含有机质，具有丰富的野生生物资源，台蘑作为当地的特色食用菌具有营养丰富、香味浓郁、味道鲜美等特性，五台山地区特殊的地理位置和生态环境为台蘑的生长创造了良好的条件[3]。已有研究表明台蘑富含多种氨基酸、维生素，且具有较高的蛋白质含量，蛋白质营养价值高于茶树菇（Agrocybe aegerita）和香菇（Lentinus edodes）[4]。

台蘑以“香蕈”和“银盘”著名，其品种主要包括以下几类[3-5]：白桩菇（Leucopaxillus candidus），即白银盘；五台杯伞（Clitocybe wutaishanensis），又称鸡爪香蕈；粉紫香蘑（Lepista personata）；紫丁香蘑（Lepista nuda），又称小香蕈；香杯伞（Clitocybe odora），又称水皮。

食用菌中酚类化合物已成为医药和食品工业中天然抗氧化剂的重要来源[6]。Islam等[7]以DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力为指标研究发现，43种食用菌均具有显著的抗氧化活性。Garrab等[8]研究证明，不同食用菌的甲醇和乙酸乙酯提取物具有高抗氧化活性，主要是由于其多酚含量较高。目前，对于五台山地区的野生食用菌研究多集中于香蕈类的营养成分组成及液体发酵培养，台蘑酚类物质组成分析及其抗氧化活性研究鲜见报道。

基于此，通过测定香杯伞、五台杯伞和紫丁香蘑3种常见野生台蘑的总酚和总黄酮含量，采用超高效液相色谱-串联质谱联用（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS） 技术对3种台蘑酚类物质进行定性定量分析，探究其酚类物质的组成，进一步进行抗氧化活性测定，为台蘑资源的营养价值开发和利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香杯伞、五台杯伞、紫丁香蘑3种野生台蘑均采自山西省忻州市五台山。

标准品：没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、水杨酸、肉桂酸、槲皮素、儿茶素均为色谱纯，纯度≥98%，购自北京索莱宝科技有限公司；DPPH，购自美国Sigma公司；总抗氧化能力试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1810PU紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器厂；KQ3200DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE52CS旋转蒸发仪，郑州贝楷仪器设备有限公司；TG16-WS台式离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；UPLC-MS/MS超高效液相串联质谱仪，美国Waters公司。

1.3 试验方法

1.3.1 台蘑总酚、总黄酮含量的测定

1） 样品前处理

参照Cheung[9]方法略作改动，将干制的香杯伞、五台杯伞、紫丁香蘑3种台蘑样品采用粉碎机打碎，过40目筛。准确称取3种台蘑粉各4 g于250 mL平底烧瓶中，加入70%乙醇100 mL，于50℃用冷凝回流装置提取1.5 h,4 000 r·min-1离心20 min，将提取液在45℃旋转蒸发仪中浓缩蒸干，用甲醇定容至5 mL，储存于-20℃以备后续测定。

2） 总酚含量测定

参照Ismail等[10]方法，以没食子酸为标准品，采用福林-酚法测定总酚含量。得到的没食子酸标准曲线回归方程为：

该回归方程的相关系数R2为0.999 1，结果表示为每克干物质中没食子酸的质量。

3）总黄酮含量测定

参照Ismail等[10]方法，以芦丁为标准品，采用硝酸铝比色法测定总黄酮含量。得到的芦丁标准曲线回归方程为：

该回归方程的相关系数R2为0.997 7，结果表示为每克干物质中芦丁的质量。

1.3.2 台蘑酚类物质的UPLC-MS/MS分析

1） 样品前处理

取提取液1 mL，经0.22 μm尼龙系微孔滤膜后，转移至棕色进样小瓶，用于UPLC-MS/MS分析。

2）标准溶液的配制

准确称取标准品各10 mg，置于10 mL容量瓶中，色谱级甲醇溶解定容。经0.22 μm尼龙微孔滤膜过滤，配制成1 mg·mL-1溶液作为混合对照溶液。在相同的测试条件下，以标准品质量浓度为基准，计算台蘑目标物质的质量浓度。

3） 色谱条件

色谱柱为AQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流动相A为乙腈溶液，流动相B为 0.05%甲酸水溶液；流速 0.3 mL·min-1；柱温30℃；进样量 5 μL；梯度洗脱程序：0～0.5 min，10% 流动相A；0.5 min～5 min，30% 流动相A；5 min～11 min，90%流动相 A；11 min～14 min，10%流动相A。

4） 质谱条件

电喷雾离子源，多反应监测模式，负离子模式下，毛细管电压2.90 kV，离子源温度120℃，脱溶剂气温度400℃，锥孔气N2流速50 L·h-1，脱溶剂气（N2）流速600 L·h-1，碰撞气（Ar）流速0.07 mL·min-1。

1.3.3 台蘑多酚的抗氧化活性测定

1）DPPH自由基清除率测定

参照 Gasecka 等[11]方法，略作改动。200 μmol·L-1DPPH溶液配制：准确量取0.1 mg·mL-1DPPH溶液48 mL，用甲醇定容在100 mL容量瓶中，4℃避光保存，现用现配。2 mL待测液及2 mL DPPH溶液加入试管中，摇匀，避光放置30 min。以甲醇为参比，于517 nm测定其吸光度值。DPPH自由基的清除率（C1，%） 的计算公式为：

式中：A0为2 mL溶剂、2 mL DPPH混合溶液的吸光度值；Ai为2 mL待测液、2 mL DPPH混合溶液的吸光度值；Aj为2 mL待测液、2 mL甲醇溶剂的吸光度值。

2）羟基自由基清除率测定

参考李白存等[12]方法，略作改动。在试管中加入1.0 mL浓度为6.0 mmol Fe2+和1.0 mL 6 mmol水杨酸-乙醇溶液，分别加1.0 mL浓度为0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、 0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1的待测液，加5 mL蒸馏水，再分别加入1 mL 6.0 mmol H2O2。混匀后静置10 min，在波长为510 nm处测定吸光度。羟基自由基清除率（C2，%） 的计算公式为：

式中:B0为以蒸馏水作空白液时的吸光度值；Bi为加入样品后的吸光度值。

3）总抗氧化能力测定

选用南京建成生物工程研究所的总抗氧化能力试剂盒进行测定，总抗氧化能力（C3，U·mL-1）的计算公式为：

式中:Ci为样品吸光度值；C0为空白吸光度值；V1为反应液总体积（mL）；V2为取样量（mL）；A为稀释倍数。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 3种台蘑的总酚及总黄酮含量比较

3种台蘑中的总酚和总黄酮含量统计结果见表1。

表1 台蘑总酚及总黄酮含量Tab.1 Contents of total phenols and total flavonoids in Taimo

如表1所示，3种台蘑的总酚、总黄酮含量具有显著性差异（P＜0.05）。其中五台杯伞的总酚和总黄酮含量最高，其总酚含量（4.83±0.03） mg·g-1是香杯伞、紫丁香蘑的1.38和1.20倍，总黄酮含量（3.69±0.06） mg·g-1是香杯伞、紫丁香蘑的2.5和1.06倍。

不同食用菌其总酚、总黄酮含量因其地理环境、栽培条件、预处理方式、提取方式等因素不同而存在差异。Palacios等[13]测定了西班牙不同地区8种食用菌总酚含量为 1 mg·g-1～6 mg·g-1,总黄酮含量为0.9 mg·g-1～3.0 mg·g-1，其中野生牛肝菌 （Boletus sp.）总酚和总黄酮含量分别为5 mg·g-1、2.2 mg·g-1,与本研究中野生台蘑略有差异。Bach等[14]对巴西多种食用菌研究发现，采用75%乙醇提取双孢蘑菇（Agaricus bisporus）和姬松茸（Agaricus blazei）中的总酚时其总酚含量最高，分别为9.97 mg·g-1和13.16 mg·g-1，金针菇 （Flammulina velutipes） 和香菇的最优提取条件则是使用25%乙醇，其总酚含量为 8.38 mg·g-1和 5.66 mg·g-1。缪钱江等[15]测定 4 种食用菌总黄酮含量，得到榆黄菇（Pleurotus citrinopileatus）、秀珍菇 （Pleurotus geesteranus）、黑木耳 （Auricularia auricula）、平菇 （Pleurotus ostreatus）的总黄酮含量分别为1.33 mg·g-1、0.87 mg·g-1、0.64 mg·g-1、3.16 mg·g-1。

2.2 台蘑多酚的UPLC-MS/MS分析

酚类化合物是食用菌中具有较高活性的次生代谢产物，依照其所含芳香酚环的数量和这些环的不同官能团，主要分为酚酸类、类黄酮类、单宁类等，具有显著的结构多样性[16]。为进一步明确台蘑醇提物的酚类物质组成，采用UPLC-MS/MS对提取液进行分析，采用多重反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）方式对样品定性定量分析，通过与标准品的母离子、子离子检测离子对及保留时间比对定性，采用外标法建立回归方程进行酚类物质定量分析。不同样品MRM色谱图见1，酚类物质质谱参数见表2。

图1 不同样品的MRM色谱图Fig.1 MRM chroma tograms of different samples

表2 酚类物质质谱检测参数Tab.2 Tandem mass spectrometric parameters for phenolic compositions

以对照品的峰面积（y） 和相应浓度（x） 进行线性回归得到的回归方程、线性相关系数，见表3。

表3 酚类物质线性方程Tab.3 Linear equations of phenolic compositions

通过统计计算，分析台蘑醇提物中酚类物质，结果见表4。

表4 台蘑酚类物质的定性和定量分析Tab.4 Qualitative and quantitative analysis of phenolic compositions in Taimo

由表4可知，3种台蘑酚类化合物组成相似，主要包括对羟基苯甲酸、肉桂酸、没食子酸、槲皮素、芦丁、原儿茶酸等，其中对羟基苯甲酸、肉桂酸含量显著高于其他酚类物质。但不同台蘑中酚类化合物含量存在差异，紫丁香蘑中对香豆酸（4.69±0.32） μg·g-1、肉桂酸 （29.34 ± 2.11） μg·g-1含量显著高于其他2种台蘑，香杯伞中对羟基苯甲酸含量（21.36±1.15） μg·g-1最高，五台杯伞中没食子酸（3.22±0.03） μg·g-1、原儿茶酸 （3.82±0.20） μg·g-1、槲皮素 （4.44±0.38） μg·g-1含量较高。Alkan等[17]研究发现肉桂酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸、原儿茶酸和没食子酸是食用菌中最常见的酚酸。采用HPLC-DAD对土耳其18种食用菌进行酚类物质含量测定，Cayan等[18]比较发现了红菇（Russula aurora） 中没食子酸 （2.96±0.56） μg·g-1、原儿茶酸（4.89±0.32） μg·g-1含量高于其他食用菌；然而在牛肝菌（Suillus granulatus） 中含量很高的儿茶素（16.59±0.71） μg·g-1，在 3种台蘑中均未测出；对羟基苯甲酸在露背菇 [Lepista nuda(Bull.)cook]中含量最高，为（5.44±0.67） μg·g-1，同样发现在3种台蘑中对羟基苯甲酸的含量显著高于其他物质。另有研究表明，对羟基苯甲酸在巴西双孢蘑菇和姬松茸中含量较高，分别达到（57.12±1.20） μg·g-1，（332.76±2.98） μg·g-1[18]。

2.3 台蘑多酚的抗氧化能力分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力的检测，是一种广泛应用于评估自由基清除剂或氢供体抗氧化能力的方法[19]。3种台蘑不同多酚浓度对DPPH自由基的清除能力见图2。

图2 台蘑多酚对DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging capacity of the polyphenols of Taimo onDPPHradical

如图2所示，3种台蘑多酚对DPPH自由基清除能力均与浓度呈正相关，但3种台蘑多酚对DPPH自由基的清除能力有明显不同。多酚DPPH自由基清除能力的大小顺序为：五台杯伞＞紫丁香蘑＞香杯伞。在多酚浓度为 0.1 mg·mL-1～3.0 mg·mL-1范围内，五台杯伞多酚的清除能力显著高于香杯伞与紫丁香蘑；多酚浓度为3.0 mg·mL-1时，五台杯伞、紫丁香蘑、香杯伞多酚的DPPH自由基清除率分别达到91.66%，87.50%和83.80%。经过分析显示，香杯伞、五台杯伞、紫丁香蘑IC50值分别为1.76 mg·mL-1、1.12 mg·mL-1、1.39 mg·mL-1。

2.3.2 羟基自由基清除率

羟基自由基作为一种得电子极强的活性氧，可通过氧化蛋白质、脂质、糖类和核酸等物质直接损伤各种生物膜，对生物机体危害极大[20]，食用菌富含的多酚类化合物对其具有较强的清除能力。3种台蘑不同浓度多酚对羟基自由基清除能力见图3。

图3 台蘑多酚对羟基自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of the polyphenols of Taimo on hydroxyl radical

如图3所示，多酚羟基自由基清除能力的大小顺序为：五台杯伞＞紫丁香蘑＞香杯伞。在多酚浓度为 0.1 mg·mL-1～1.0 mg·mL-1范围内，随着多酚浓度的增大，羟基自由基清除率也随之提高；在多酚浓度为 1.0 mg·mL-1～3.0 mg·mL-1范围内，羟基自由基清除率逐渐趋于平缓，并达到最大清除率；多酚浓度为2.0 mg·mL-1时，3种台蘑多酚的羟基自由基清除率均达到100%。香杯伞、五台杯伞、紫丁香蘑IC50值分别为 0.47 mg·mL-1、0.35 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1。

2.3.3 总抗氧化能力

食用菌中多酚类抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，Fe2+与菲啉类物质形成稳固络合物，通过比色可测定出其抗氧化能力高低。采用T-AOC法测得3种台蘑不同多酚浓度的总抗氧化能力见图4。

如图4所示，3种台蘑多酚的总抗氧化能力均与其浓度呈正相关，且在相同浓度下五台杯伞的总抗氧化能力显著高于其他2种台蘑。多酚的总抗氧化能力大小顺序为：五台杯伞＞紫丁香蘑＞香杯伞。当多酚浓度达3 mg·mL-1时，香杯伞、五台杯伞、紫丁香蘑的总抗氧化能力分别为9.790 U·mL-1，18.655 U·mL-1，14.130 U·mL-1。

图4 台蘑多酚的总抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capacity of Taimo polyphenols

2.4 台蘑活性成分与其抗氧化活性的相关性分析

多酚类化合物是一种有效的天然抗氧化剂，通过不同的抗氧化机制发挥作用。已有研究表明，食用菌多酚化合物可作为电子供体，中和自由基或与金属离子螯合，抑制氧自由基的产生，通过阻止自由基链式反应以及脂质过氧化，从而避免机体氧化损伤；此外，多酚类化合物还可通过酶抑制作用发挥抗氧化活性[21]。且目前也有研究表明，食用菌酚类物质的定量和定性特征可影响其抗氧化能力[22]。基于上述多酚化合物组成的分析，选定3种台蘑多酚化合物中的几种含量相对较高的主要酚类成分与抗氧化指标进行皮尔逊相关性分析，以期发现台蘑多酚抗氧化活性与组成之间的关系。3种台蘑活性成分与其抗氧化活性的相关性分析见表5。

如表5所示，酚酸类物质中没食子酸、原儿茶酸与DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、总抗氧化能力均具有显著相关性。Sezgin等[6]通过对土耳其5种食用菌醇提物抗氧化活性研究发现，绿原酸、没食子酸、原儿茶酸是其发挥高抗氧化活性的主要酚酸组成，与本研究结果相似。对羟基苯甲酸、肉桂酸与DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力呈负相关性，分析二者与台蘑多酚发挥抗氧化活性无较大关联。黄酮类物质中槲皮素与DPPH自由基清除能力呈显著正相关（r=0.831），芦丁与各抗氧化指标间相关性不高，说明槲皮素相对于芦丁，在台蘑多酚抗氧化活性中贡献更高。Seer－am等[23]研究发现C环所连接的糖苷糖单位数越多相应的抗氧化能力越弱，据此可推测槲皮素抗氧化活性高于芦丁，与本研究中分析结果一致。袁博等[24]通过综合评价咖啡酸、芦丁、阿魏酸、槲皮素的抗氧化活性发现，槲皮素的抗氧化活性优于芦丁，进一步验证了本试验结果。由以上分析可看出，多酚的羟基数目和位置对其抗氧化活性具有很大影响，由于本研究中存在其他未知酚类物质未检出，无法断定酚类物质结构与活性相关性以及是否存在酚类物质间的协同效应，还需后续进一步深入研究。

表5 台蘑活性成分含量与抗氧化活性的相关性分析Tab.5 Correlation analysis of the content of active components and antioxidant activity of Wutai edible fungis

3 结论

食用菌的多酚类物质种类多样，且具有多种生理活性。研究结果表明，香杯伞、五台杯伞、紫丁香蘑3种野生台蘑均富含酚类化合物，其中五台杯伞总酚和总黄酮含量最高；进一步采用UPLC-MS/MS法对3种台蘑多酚类物质进行定性定量分析，鉴定出台蘑多酚中含有8种酚酸类和2种黄酮类物质，其中对羟基苯甲酸、肉桂酸、没食子酸、原儿茶酸、槲皮素、芦丁含量较高。体外抗氧化试验结果表明，五台杯伞抗氧化活性高于香杯伞和紫丁香蘑，经皮尔逊相关性分析发现，没食子酸、原儿茶酸、槲皮素与台蘑多酚抗氧化活性具有显著正相关性。对3种台蘑中10种多酚类化合物种类和含量的阐述，可为台蘑的加工利用提供一定参考。