宋京芝 马晏然 李宏 李云霞 周璇 项锋钢

(青岛大学附属医院病理科，山东 青岛 266003)

神经内分泌肿瘤(neuroendocrine neoplasm，NEN)是起源于肽能神经元和神经内分泌细胞的异质性肿瘤。消化系统NEN的病理诊断名称、分类和分级现逐渐趋于统一。第5版《WHO消化系统肿瘤分类》中对神经内分泌瘤G3(neuroendocrine tumor，NET G3)与神经内分泌癌(neuroendocrine carcinoma，NEC)的鉴别进行了阐述[1]。两组肿瘤的诊断是基于肿瘤的组织学和增殖程度(核分裂象及Ki-67指数)的评估，如仅靠组织学对两者进行鉴别，约2/3病例的诊断存在争议[2]，且Ki-67指数又不能将NET G3与NEC鉴别开来。因此，在缺乏典型的组织学表现(特别是活检标本)时，两者的鉴别仍然比较困难。美国纪念Sloan-Kattering癌症中心的研究结果显示，NET G3患者的5年生存率大约为29.1%，而NEC患者则约为16.3%[3]。NET G3患者对化疗不敏感，可用生长抑素类似物、靶向药物等治疗，而NEC患者对化疗的灵敏度较高[4]。两者的治疗策略与临床预后等有显著差异，因此二者的正确诊断极为重要。

针对胰腺NEN的遗传学研究表明，胰腺NEC患者存在TP53及RB基因的异常，其在分化良好胰腺NET患者中较罕见[5]。“2020年中国胃肠胰NEN病理诊断共识”中也提及消化系统NEC患者常出现TP53和RB抑癌基因失活，免疫组织化学(IHC)的检测结果显示NEC患者中p53异常表达者约占76%，Rb异常表达者约占22%～58%，然而NET患者不存在TP53和RB基因的异常表达[6]。

本研究回顾性分析97例NEN病例，采用IHC染色检测p53及Rb的表达，结合其临床病理资料和随访数据，初步探讨准确鉴别消化系统NEC和NET G3的重要临床意义，为患者今后的精准治疗提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集2010年8月—2020年8月我院病理学检查诊断为消化系统NEC(93例)及“高增殖活性”NET(4例)并行根治性切除的手术标本共97例，其中12例手术标本NEC有对应的活检标本。电话随访97例NEN患者，截至2021年7月31日，失访患者10例。NEC患者术后满5、3、1年且随访资料完整者分别有36、52、83例。“高增殖活性”NET患者4例，均术后随访满3年，不满5年，随访资料完整。本研究针对随访5、3、1年的NEC患者以及随访3年的“高增殖活性”NET患者进行预后分析。

1.2 IHC染色检测p53及Rb的表达

采用IHC染色检测每例肿瘤组织标本p53及Rb的表达。抗体p53购自福州迈新生物技术开发有限公司，抗体Rb Gene Protein购自北京中杉金桥生物技术有限公司。按照说明书进行操作。用PBS代替一抗作为阴性对照。IHC结果判读标准参考相关文献[7]。

1.3 数据处理

采用SPSS 23.0统计软件进行分析，Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，使用Cox风险比例回归模型进行多因素分析。采用最大偏似然估计似然比检验(LR)法筛选变量。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 组织学及IHC染色检测结果

复检93例原诊断为NEC患者中，最终有5例被重新归类为NET G3；复检4例原诊断为“高增殖活性”NET病例中，最终3例被重新归类为NEC。最终所有病例中91例被明确诊断为NEC，6例明确诊断为NET G3。

NET G3细胞多呈推挤式生长，肿瘤细胞形态温和，呈巢状、小梁状或腺管样结构，染色质细腻，核仁不明显，周围有丰富的小血管和多少不等的纤维间质(图1A、B)。IHC染色显示，6例NET G3均无Rb及p53的异常表达(图1C、D)。NEC细胞呈弥漫浸润性生长，细胞异型明显，染色质粗糙，核分裂象易见，可见核仁及坏死，有杂乱的大血管和促结缔组织增生性间质。组织类型分为大细胞型NEC(LCNEC)(图2)及小细胞型NEC(SCNEC)(图3)。NEC中p53和(或)Rb异常表达者约占89.0%(81/91)，仅p53异常表达者约占85.7%(78/91)，仅Rb异常表达者约占57.1%(52/91)，同一病例p53及Rb均异常表达者约占53.8%(49/91)。

A:HE染色，200倍；B:HE染色，400倍；C:Rb表达，PV6000法，400倍；D:p53表达，PV6000法，400倍

A：HE染色，400倍；B：Ki-67表达，PV6000法，400倍；C：Rb表达，PV6000法，400倍；D：p53表达，PV6000法，400倍

A：HE染色，400倍；B：p53表达，PV6000法，400倍；C：Ki-67表达，PV6000法，400倍；D：Rb表达，PV6000法，400倍

对原诊断为NEC的12例患者的活检标本及其对应的手术标本进行复核，结果显示，诊断正确率为100%。两者在组织学表现方面及IHC检测相应的结果上大致相同。活检标本具有经典组织学和细胞学特征，包括浸润性生长模式、异型性明显的细胞形态以及促纤维结缔组织增生性间质，并伴有多灶坏死等表现。

2.2 NEC的临床病理及患者的预后情况

91例NEC患者中，男74例，女17例；年龄28～84岁，平均年龄(61.1±9.8)岁；其中LCNEC患者42例，SCNEC患者49例。肿瘤原发于胃部约占50.5%(46/91，含2例肝转移灶)，其次为结直肠约占19.8%(18/91，含3例肝转移灶)，胆管及胆囊约占9.9%(9/91,含1例肝转移灶)，食管约占7.7%(7/91)，十二指肠约占6.6%(6/91)，胰腺约占4.4%(4/91)，肝脏约占1.0%(1/91)，经相关检查未发现其他部位病灶。在手术切除标本中，肿物平均最大径(4.7±2.8)cm，神经侵犯和脉管癌栓的发生率分别约为37.4%(34/91)和41.8%(38/91)。进行周围淋巴结清扫的病例中，淋巴结转移比例约达39.3%(33/84)。远处转移发生率约占12.1%(11/91)，其中肝脏为最常见的转移部位(6/91)，其次为肾上腺(3/91)及腹膜(2/91)。

81例患者成功随访，随访时间12～132个月，术后1、3、5年平均总生存期(OS)分别为10.7、24.0、31.2个月，42例患者现复发转移，术后1、3、5年平均无病生存期(DFS)分别为8.9、19.9、26.4个月。以随访截止日NEC患者生存时间和生存情况为因变量(存活=0，死亡=1)，以组织学类型(大细胞型=0，小细胞型=1)，肿瘤部位(胃=0，结直肠=1，胆管及胆囊=2，食管=3，十二指肠=4，胰腺=5，肝脏=6)，肿瘤大小(最大径≤2 cm=0，>2 cm=1)，脉管癌栓(否=0，是=1)，神经侵犯(否=0，是=1)，淋巴结转移(否=0，是=1)为自变量，纳入Cox风险比例回归模型。单因素分析显示，组织学类型、脉管癌栓、淋巴结转移是NEC患者术后3年OS和DFS的影响因素(P<0.05)。将单因素分析中有统计学差异的因素纳入多因素Cox回归分析，多因素Cox回归分析结果表明，小细胞型及有淋巴结转移是NEC患者术后3年OS和DFS的独立危险因素(P<0.05)。SCNEC患者术后1、3、5年平均OS和DFS较LCNEC患者更短(P<0.05)。见图4。单因素及多因素Cox回归分析显示，肿瘤部位、大小及是否神经侵犯与患者的生存时间均无明显关系(P>0.05)。见表1、2。

A:患者术后1年OS曲线，B:患者术后1年DFS曲线，C:患者术后3年OS曲线，D:患者术后3年DFS曲线，E:患者术后5年OS曲线，F:患者术后5年DFS曲线

表1 单因素和多因素Cox回归模型分析NEC患者术后3年OS的影响因素

表2 单因素和多因素Cox回归模型分析NEC患者术后3年DFS的影响因素

2.3NET G3的临床病理及患者的预后情况6例NET G3患者中，男4例，女2例；年龄为52～67岁，平均年龄(59.0±4.9)岁。肿瘤原发于胃3例，胰腺3例。肿物平均最大径(4.3±1.7)cm。发生神经侵犯和脉管癌栓分别为3例和4例，淋巴结转移2例，均无远处转移。

6例患者成功随访，随访时间36～94个月。1例患者出现复发，6例患者均存活。术后3年平均DFS为34.0个月。因肿瘤病例较少，未对NET G3患者进行单因素及多因素Cox回归分析。

2.4 NET G3与NEC的预后比较

本研究中NET G3病例较少，对NET G3和NEC进行初步比较分析。NET G3患者术后3年平均OS和DFS(分别为36.0、34.0个月)较NEC患者(分别为24.0、19.9个月)显著延长(χ2=6.014、5.930，P<0.05)。见图5。

图5 NET G3与NEC患者术后3年生存曲线

3 讨 论

临床上，NET G3疾病概念的提出过程较为漫长。此前，病理医师是以2010年第4版《WHO消化系统肿瘤分类》中胃肠胰NEN分类诊断标准[8]中按核分裂象及Ki-67指数进行肿瘤分级。但在后续临床研究和实际工作中，发现有一部分分化良好的胰腺NEN G3患者的预后较分化差的NEN G3患者更好[9-10]。“2013年中国胃肠胰NEN病理诊断共识”初次提出“高增殖活性”NET的概念[11]，但无具体诊断标准及辅助诊断指标。2015年，日本TAKIZAWA等[12]对大肠NEC的分子特征进行了分析，结果显示NEC患者有TP53及RB基因异常，但在NET患者中未检测到TP53及RB基因的异常；同时IHC检测显示NEC患者中p53异常表达率约为88%，Rb异常表达率约为56%。2017年WHO内分泌肿瘤中胰腺NEN分类[13]首次提出，分化良好的NET中也存在高级别G3的类型。2019年第5版《WHO消化系统肿瘤分类》[1]中正式有了NET G3的诊断命名。本研究复检的93例原诊断为NEC的患者，经组织学并结合IHC检测最终有5例被重新归类为NET G3；复检的4例原诊断为“高增殖活性”NET的患者，最终有3例被重新归类为NEC。结果显示，NET G3在组织学上，经多点仔细寻找可发现存在良好分化的肿瘤区域；而NEC肿瘤组织分化较差，未见良好分化的肿瘤区域。IHC检测显示，NET G3的患者均无p53及Rb异常表达；而NEC患者中p53和(或)Rb异常表达者高达89.0%。研究结果提示，p53及Rb检测对于NEC及NET G3具有较高的辅助鉴别价值。本研究复检的12例诊断为NEC的活检标本，尽管与后续手术切除后的大标本的诊断结果相一致，但发现相对于大标本其组织学诊断更为困难。由于研究收集的活检标本均为NEC，其组织学及IHC检测结果与相应的手术标本相同，因此诊断符合率高。随着NET G3的提出，要求我们对活检标本的诊断必须更为准确。值得注意的是，NET可以发生肿瘤的升级，即由G1/2期转变为G3期，因此NET G3常伴有分化好的神经内分泌瘤(NET G1/2)的区域；而NEC与NET进展无关，一般也没有经典的NET形态[14-15]。因活检标本组织的局限性，仅靠组织学对活检标本做出诊断有时困难，因此建议同时进行相应IHC的检测，最大限度消除标本局限性带来的误诊，做到更为精确的诊断。

STROJAN等[16]对喉的LCNEC及SCNEC的高质量文献进行综合性回顾分析发现，组织学为小细胞型的NEC患者较大细胞型预后更差，这可能与SCNEC肿瘤细胞的Azzopardi现象有关，即因肿瘤细胞溶酶体膜功能不全，使细胞核中DNA外溢，而这种现象使得肿瘤细胞更容易弥散并浸润血管壁。本研究重新归类的91例NEC患者，单因素分析显示，组织学类型、脉管癌栓、淋巴结转移是NEC患者术后3年OS和DFS的影响因素。多因素Cox回归分析表明，小细胞型及有淋巴结转移是NEC患者术后3年OS和DFS的独立危险因素。提示临床上可以考虑将上述指标用于NEC患者的风险分层和预后评估。

有研究表明，NET G3常原发于胰腺[17]。国内研究也显示NET G3患者的肿瘤部位、大小、脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移与生存时间无显著相关性[18]。目前认为NET G3患者比NEC患者预后更好。研究显示，NET G3患者的中位OS可达33～98个月，明显高于NEC患者的11～17个月[19-20]。胰腺NET G3患者的中位OS为42～75个月，而胰腺NEC患者的中位OS仅有8.5～13.0个月[21]。本研究结果显示，6例NET G3患者，仅1例患者出现复发，术后3年平均DFS为34.0个月；NET G3患者术后3年OS和DFS较NEC患者更长。本研究由于NET G3患者较少，仅有6例，未对NET G3患者进行单因素及多因素Cox回归分析，后续需加大样本量，深入分析NET G3患者预后的影响因素，为患者的预后评估及精准治疗提供依据。

综上所述，NET G3作为一种新分类的肿瘤，仅靠组织学将其与NEC鉴别较为困难，结合p53、Rb检测可以提高医师的鉴别能力。小细胞型、有淋巴结转移是NEC患者OS和DFS的独立危险因素，可以考虑用于NEC患者的风险分层和预后评估。提高对NET G3及NEC的认识，可以帮助临床选择正确的治疗策略和准确评估患者预后。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL26938)。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No. QYFYWZLL26938). Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者贡献：宋京芝、项锋钢、周璇参与了研究设计；宋京芝、马晏然、李云霞和李宏参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions： The study was designed bySONGJingzhi,XIANGFenggang, andZHOUXuan.The manuscript was drafted and revised bySONGJingzhi,MAYanran,LIYunxia, andLIHong. All the authors have read the lastversion of the paper and conserted submission.