王晓云解加卓孙中涛史庆华杨越超*

土元壳和卵鞘中甲壳素结构特征与比较分析

王晓云1,2,解加卓2,孙中涛3,史庆华1,杨越超2*

1.山东农业大学园艺科学与工程学院, 山东 泰安 271018 2.山东农业大学资源与环境学院土肥高效利用国家工程研究中心, 山东 泰安 271018 3. 山东农业大学生命科学学院, 山东 泰安 271018

本研究采用酸碱法从土元壳和孵化后的卵鞘中分离甲壳素。通过傅里叶变换红外光谱、x射线衍射、热重分析和扫描电镜分析对提取的昆虫甲壳素的理化性质进行测定，并进行比较不同材料来源的甲壳素物理结构的异同。结果表明，来源于土元壳的甲壳素与来源于卵鞘的甲壳素物理特性不同。土元壳甲壳素的红外光谱图谱显示酰胺带Ⅰ在1659和1628cm-1处分裂为两个峰，卵鞘的在1633cm-1处为单峰；XRD显示土元壳甲壳素具有较强峰，而卵鞘的峰较弱；热重分析显示土元壳甲壳素降解温度高于卵鞘的，这些特征显示土元壳甲壳素具有-甲壳素特征，卵鞘的则具有-甲壳素特征。这些结果将有助于昆虫甲壳素的进一步开发与应用。

土元; 卵鞘; 甲壳素; 结构特征

甲壳素是以单体-(1-4)-N-乙酰-D-葡萄糖胺为单元的生物聚合物，其衍生物壳聚糖是甲壳素部分脱乙酰后得到的一种线性多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖单元和D-氨基葡萄糖单元组成。甲壳素及其衍生物是地球上仅次于纤维素的天然长链多糖，作为一种天然生物聚合物具有生物相容性、可降解性、非毒性等生物特性，在复合材料、生物医药、化妆品、食品、农业、和废水处理等领域有着广泛的应用前景，多年来一直是研究人员关注的焦点[1-4]。甲壳素广泛分布于节肢动物、软体动物、环节动物及真菌和酵母中，大量生产甲壳素的原料主要是海洋甲壳纲动物（如虾、龙虾和螃蟹等）的壳[5-8]。

近年来，人们对来源于昆虫中的甲壳素和壳聚糖的研究颇有兴趣[3,9,10]。在国外，昆虫因其高蛋白含量而受到广泛关注，如黄粉虫、蝇蛆等昆虫作为健康食品/饲料在世界各地被消费，并获得欧盟委员会批准作为一种新型食品[11,12]。在中国，昆虫因其多种的应用价值备受关注，根据昆虫用途不同，被分为食用资源昆虫、医药资源昆虫、饲料资源昆虫、工业原料资源昆虫、观赏资源昆虫、娱乐资源昆虫、害虫天敌资源昆虫、植物传粉资源昆虫和其他用途的资源昆虫[13]。药用资源昆虫是中国医药宝库中特有的一个重要部分，已经有3 000多年的历史，目前记载入药的昆虫达两百多种[14,15]。由于野生资源的急剧减少，药用昆虫数量需求的增加，地鳖虫、蜜蜂、斑螯、洋虫、五倍蚜和紫胶虫等部分药用昆虫已经成功实现规模生产，为人们提供了充足的药源[15,16]。

土元，学名中华真地鳖虫(Walker)，是昆虫纲中以雌虫干燥体为中药的昆虫，具有活血化瘀的功用，现代生化分子及药理试验也证明了土元具有抗凝血、抗肿瘤、抑制血小板聚集、溶解静脉血栓等药效[17,18]。随着科技进步和人们对土元的深入研究，土元及其副产品逐步进入药品、保健品、饲料、有机肥等行业当中，也已经实现了规模化立体养殖[19,20]。昆虫表皮的主要成分被普遍认为是甲壳素等有机材料的有效替代来源，特别是含有低水平无机物的角质层[3,21]。研究发现，土元虫体、蜕皮、卵鞘等含有大量的甲壳素类物质，其全虫、体壁、蜕和刚蜕皮的雌成虫甲壳素平均含量分别为11.50%，12.99%，11.02% 和3.15%[22,23]。如果不能资源化利用，不仅造成浪费，还污染环境，如天津市武清县某一养殖公司每年卵鞘等部分丢弃量就达10余t[24]。另外，山东、河南、江苏等地都有土元养殖合作社，卵鞘和土元壳的量都较大[25]。本研究是利用土元养殖场产生的土元壳和卵鞘，进行甲壳素的资源化提取、特征分析，并比较二者提取物质的异同，旨在为昆虫甲壳素类物质的应用提供理论依据，同时为土元养殖产生的废弃物资源化利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

土元壳（简写为T）和卵鞘（简写为L），均购自山东曹县土元养殖合作社。将土元壳（T）和卵鞘（L）分别用水清洗，然后在60℃烘箱干燥48h后备用。甲壳素提取的化学物质为盐酸、氢氧化钠和过氧化氢，所用试剂均为分析级，购自天津市北方天医化学试剂厂。

1.2 甲壳素的提取

甲壳素处理方法参考唐庆峰等[22]方法：将干燥的土元壳（T）和卵鞘（L），先用5% HCl脱钙2h，自来水冲洗至中性，然后用5% NaOH脱蛋白2h，过滤后用10% NaOH处理1h，清洗至中性后烘干，得到甲壳素粗品（T1、L1），再采用10% H2O2脱色，在60℃条件处理1h，在室温下放置24h后，进行过滤，滤渣为白色的甲壳素（T3、L3）。

1.3 甲壳素的表征

1.3.1 红外光谱（FT-IR）通过酸碱法得到的甲壳素粗产品和脱色后的甲壳素产品采用FT- IR（Nicolet IS10尼高力红外光谱仪，USA）进行表征。FT- IR光谱扫描范围400～4000 cm-1，光谱分辨率为4cm-1。每个样本共进行64次扫描。

1.3.2 X射线分析对产品进行X射线衍射（X射线衍射仪D8 ADVANCE，BRUKER，GErM）表征。样品均匀干燥，粒度小于70μm（过200目）。管电流：10～60mA，管电压：20～60kV(1kV/1step)；角度范围（2θ）：5～40°；温度范围：室温～600℃；测角仪半径≥200mm。

1.3.3 热重分析采用热重分析仪（MEITTLER TGA/DSC 1 SF/1382，USA），对提取的甲壳素产品的热降解性能测试。从每个样品取10.00 mg，试验在氮气环境下以10℃·min-1的升温速率进行。

1.3.4 扫描电镜分析采用扫描电镜（SU8010SEM，JAP）观察所有样品的微观结构和形貌。同时通过对样品微区、亚微区成分进行分析定性、定量分析，可确定样品的组成。分辨率：1.0 nm(15kV)；1.4nm (1kV，WD=1.5 mm，减速模式)；2.0 nm(1kV，WD=1.5 mm，普通模式）。为了获得清晰准确的图像，对样品进行了喷金处理。

2 结果分析

2.1 甲壳素提取物及红外光谱分析

通过酸碱法从土元壳（T）和卵鞘（L）得到的脱色前的粗提取物（T1和L1）和脱色后的产品（T3和L3），粗提物脱色后的甲壳素为不溶于水的白色片状物质如图1。来源不同的粗体物和甲壳素产品，从颜色看甲壳素都是白色，但土元壳的甲壳素质地较软，而卵鞘甲壳素较脆。

图1 土元壳和卵鞘粗提物和甲壳素

T1：从土元壳提取的粗提物；T3：土元壳甲壳素；L1：从卵鞘提取的粗提物；L3：卵鞘甲壳素。下同。

T1:Crude extract extracted from Slough; T3: Chitin from Slough; L1:Crude extract from Ootheca; L3: Chitin from Ootheca. Same as follow.

由图2知，土元壳的提取物中，在1 628～1 659 cm-1，1 557 cm-1和1 260～1 320 cm-1处具有甲壳素典型的酰胺Ⅰ谱带、酰胺Ⅱ谱带、酰胺Ⅲ谱带出现的位置，且T1在1 630 cm-1和1 656 cm-1、T3在1 628 cm-1和1 659 cm-1在均被分成两个谱带，这是α-甲壳素的特征。而土元卵鞘产物分别在1 632 cm-1，1 515 cm-1和1 236 cm-1具有3个谱带的吸收峰。另外，土元壳提取物T1在3 429 cm-1和T3在3 446 cm-1处表现振动谱带，对应于-OH的伸缩振动峰，二者均在3 107 cm-1和3 270 cm-1附近具有-NH的伸缩振动峰；而L1和L3在3 407 cm-1附近的谱带对应于-OH伸缩振动峰；四种物质均在2 870～2 962 cm-1的范围内具有次甲基、亚甲基和甲基的伸缩振动引起的振动峰。

3.2 X衍射图谱

由图3 XRD图谱知，土元壳提取物T1在2θ= 9.12°、19.17°、20.69°、26.57°和27.46°，T3在2θ= 9.12°、19.18°、20.79°、26.57°和27.82°附近具有衍射吸收峰。而土元卵鞘提取物L1在2θ = 9.12°、19.45°和29.42°，L3在2θ= 9.30°、18.83°、和26.57°附近具有较弱的吸收峰。

图3 土元壳和卵鞘粗提物和甲壳素的XRD谱图

2.3 热重分析

图4 热重分析

由图4可以看出，提取物的热重曲线上均表现出两个降解阶段，第一阶段质量损失是由于所获得的甲壳素中水分蒸发所致，土元壳的提取物最大失重温度稍高于卵鞘的，T1和T3的失重率分别为6.3%和2.7%，L1和L3失重率分别为5.1%和4.2%。第二阶段的质量损失是由于多糖结构分解，甲壳素分子脱去乙酰基，土元壳提取物最大失重温度分别为380.0和370.4 ℃，相对应的失重率分别为50.8%和68.2%，而卵鞘提取物L1和L3的最大失重温度分别为338.5和341.3 ℃左右，相应的失重率分别为68.8%和75.8%。提取物的残留率率相比，L1（25.1%）高于L3（20.0%），T1（42.9%）高于T3（29.1%），从土元壳中所获得的甲壳素的残留率高于从卵鞘中获得的。

表 1 热重分析

2.4 扫描电子显微镜

图5是通过扫描电子显微镜技术得到图像，通过表面形态SEM分析，可以看出土元壳和卵鞘的提取物的表面结构具有纳米纤维的形态，与样品的基本结构相似。土元壳粗提物T1表面光滑，有少量矿物质晶粒，表面毛刺直立；经过氧化氢脱色处理后，T3表面有网状结构，毛刺变软。卵鞘的L1表面有起伏的龙骨，没有任何孔隙和空隙。表面矿物质晶粒较多，脱色后，表面的晶粒减少。表面元素分析显示C、O、Ca三种元素含量高，Mg和S含量少。

图5 土元壳和卵鞘粗提物和甲壳素的SEM图及元素分析

3 讨论与结论

昆虫甲壳素在其不同的身体部位以及不同的发育阶段，如幼虫、蛹和成虫的甲壳素分布有所不同[2,21,22]。采用FT-IR、XRD、TGA和SEM等发现，土元壳和土元卵鞘的壳中甲壳素结构不同。红外光谱可用于研究甲壳素晶型结构，甲壳素有典型的三个酰胺谱带，1 650 cm-1左右是酰胺1谱带，1 555 cm-1左右是酰胺Ⅱ谱带，1 310 cm-1左右是酰胺Ⅲ谱带[26,27]。-甲壳素是由反向排列的糖链组成，酰胺Ⅰ带的吸收在1655和1620cm-1附近会出现两个吸收峰，而-甲壳素是由同向排列的糖链组成，一般仅出现一个吸收峰[27,28]。本研究发现，土元壳在1658和1628 cm-1附近为双峰，卵鞘在1633cm-1附近为单峰，因此，初步判断土元壳提取物均是-甲壳素，卵鞘提取物均是-型甲壳素。Kaya M[29]对3种蟑螂（东方大蠊、德国小蠊、美洲大蠊）的卵鞘甲壳素进行红外光谱分析，分别在1651、1621和1555 cm-1、1656、1621、1542 cm-1和1574、1623、1537 cm-1处观测到红外光谱，符合-甲壳素特征。目前，所有节肢动物的角质层中都发现了异型体，并被认为这是蜕皮动物的一个非异型特征[30]。但由于红外光谱受到脱乙酰度和结晶度的影响[31]，提取物的具体结构还要参照其他方法。

Jang MK等[32]研究表明，-甲壳素在9.6、19.6、21.1和23.7处有四种晶体反射峰，而-甲壳素在9.1和20.3处有两个晶体反射峰。本研究从XRD衍射图可以看出，土元壳的甲壳素有5个峰，其中有两个尖锐的峰，与-甲壳素的XRD图谱相似；卵鞘的衍射峰少、强度较小、峰形较宽，与-甲壳素的图谱相似。Kaya M等[27]认为在XRD衍射图中，尖峰表明材料具有较高的结晶度，-甲壳素比-甲壳素具有更强的晶体结构。

结晶性不同，热稳定性也不同，300℃以上的温度，直接从晶体发生热分解，因而热分解温度表征了结晶的稳定性[28]。本研究中土元壳提取的甲壳素最大降解温度(DTGmax)约为367.8和384.1℃，而从卵鞘提取的物质最大降解温度分别为338.5和341.3℃，这与Kaya M等[27]的研究结果一致。DTGmax常用于确认甲壳素异构体，DTGmax值小于350℃是-甲壳素，而大于350℃是-甲壳素[32,33]。Sagheer FAA等[34]认为-甲壳素异构体的低热稳定性归因于其较低的晶体结构。在-甲壳素中，多糖链以反平行的方式排列，导致片间和片内的氢键很强。相比之下，-甲壳素薄片采用平行构型，链间形成较弱的片内氢键网络。

前人研究了鱿鱼骨中分离得到了-甲壳素，并与虾类分离得到的-甲壳素进行了比较，发现β-甲壳素在碱性脱乙酰反应中的活性明显高于-甲壳素，且在去乙酰化过程中更容易破坏无定形的晶体结构。-甲壳素对有机溶剂和水具有良好的亲和力，-甲壳素和壳聚糖也表现出比-甲壳素和壳聚糖高得多的吸湿性和吸水率，被认为是一种有用的高亲水性材料[35]。土元卵鞘甲壳素的型结构的理化性质有待进一步研究。

此外，利用扫描电镜可对提取甲壳素前后的昆虫角质层进行原位观察，分离角质层甲壳素的SEM显示清晰的甲壳素束，其观察结果与甲壳素的已知特征一致。Kaya M等[36]利用扫描电镜对3种蟑螂的卵鞘进行了物理化学研究，发现三种蟑螂卵鞘的甲壳素表面形态呈高度纤维状，并伴有一些高度且很少多孔的区域。对舌形虫甲壳素上进行扫描电镜观察的结果一致[37]。相比之下，在研究的少数β-甲壳素例子中，纤维几乎不可见[27,35]，这一观察对鉴别甲壳素异型的意义尚不完全清楚。

4 结 论

土元是一种传统的中药材，目前主要靠养殖获得原料，土元的养殖技术和养殖规模不断扩大，已经实现了工厂化养殖，这为甲壳素工厂化提供了条件。从土元壳和卵鞘中提取的物质进行红外光谱分析，X射线衍射及热重分析，均发现其结构不同，来源于土元壳的甲壳素是-型，卵鞘的为-型。本研究结果为昆虫甲壳素进一步的开发利用提供了理论支持。

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Structure Characteristics and Comparison of Chitin from Slough and Ootheca of

WANG Xiao-yun1,2, XIE Jia-zhuo2, SUN Zhong-tao3, SHI Qing-hua1, YANG Yue-chao2*

1.271018,2.271018,3.271018,

In this study, crude extract and chitin were isolated from Eupolyphaga slough andootheca after hatching by acid-base method. The physical properties of the extracted insect chitin were determined using Fourier transform infrared spectroscopy, X-ray diffraction, thermogravimetric analysis and scanning electron microscopy and compared the properties of them. The results showed that the physical properties of the chitin from Eupolyphaga sloughs were different from those from oocytes. The IR spectra of the extracts from sloughs showed that the amide Ⅰ was split into two peaks at 1659 and 1628 cm-1, and the extracts from ootheca had one peak at 1633 cm-1. The XRD results show that the extracts from sloughs have strong peaks, and thermogravimetric analysis showed that the degradation temperature of extracts was higher than these from ootheca. These characteristics indicated that the extracts were chitin that crude extract and chitin were isolated from Eupolyphaga slough had α-chitin structure, while these from ootheca had β-chitin characteristics. These results will contribute to the further development and application of insect chitin.

; ootheca; chitin; structure characteristics

Q969.9

A

1000-2324(2022)02-0215-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.02.006

2021-12-10

2022-02-20

山东省蔬菜产业技术体系SDAIT-05;山东农业大学科研启动资助经费(72098);山东省重点研发计划子课题(2021CXGC010810-03);中国博士后科学基金(294570);山东省重大科技创新工程(Grant No. 2021CXGC010804-05-02);国家重点研发计划(Grant# 2021YFD190090103)

王晓云(1975-),女,研究生,讲师,研究方向:蔬菜栽培生理. E-mail:wxyun02@163.com

Author for correspondence. E-mail:yangyuechao2010@163.com