李雪婷，伊雄海*，樊 祥，蔡文瑄，邓晓军，郭德华，丁 涛，柳 菡，钮 冰，曾 静

（1.上海大学生命科学学院，上海 200444；2.上海海关动植物与食品检验检疫中心，上海 200135；3.南京海关动植物与食品检测中心，江苏 南京 210001）

橄榄油是以油橄榄的果实作为原材料，通过物理压榨法获得，并且不得掺入其他种类的油[1]。橄榄油含有丰富的不饱和脂肪酸、角鲨烯、多酚、维生素等物质，具有抗氧化、调节胆固醇、预防癌症、美容等功效，享有“液体黄金”的美誉。GB 23347ü2009《橄榄油、油橄榄果渣油》中对规定橄榄油的种类作出了明确的划分：初榨橄榄油、精炼橄榄油、混合橄榄油。初榨橄榄油又分为特级初榨橄榄油、中级初榨橄榄油和初榨油橄榄油[2]。特级初榨橄榄油是采用机械冷压榨的方式直接从油橄榄的果实榨取的油脂，不需要添加任何化学试剂或采用任何化学手段，只需离心过滤除去杂质即可。精炼橄榄油是油橄榄果渣油或初榨橄榄油经过精炼工艺制成的无香、无色、无味的可以食用的油，精炼过程破坏了橄榄油的口感和基本的多酚抗氧化物，营养价值和口感与特级初榨橄榄油也相差甚远。特级初榨橄榄油因其营养价值高、生产率相对较低，消费旺盛，一直被认为是一种高经济价值的食用油，市面上的特级初榨橄榄油掺假、以次充好、产地冒用等违法行为屡禁不止，据相关机构统计数据，全球橄榄油年产量只有300万 t，其中仅25%为特级初榨橄榄油，而橄榄油的销量数据显示，全球橄榄油交易量65%为特级初榨橄榄油，由此可见，其产量远不能满足市场需求[3-4]。为了保护消费者的相关利益，除了制定与实施各种标准法规以外，开发有效的橄榄油掺伪检测及等级鉴别手段，一直以来都是国内外学术界的研究热点[5]。

目前橄榄油掺伪鉴别主要以甾醇、脂肪酸、挥发性物质、蜡含量为目标物进行检测[6-10]。Yang Yang等[7]采用气相色谱-质谱法通过测定食用油中脂肪酸含量，成功鉴别出掺有4种植物油的特级初榨橄榄油。由于不同等级的橄榄油组成相似，且不法商贩会在精炼橄榄油里添加目标检测物，所以上述目标物往往无法满足对橄榄油等级的准确鉴定，常被用来鉴别橄榄油中加入其他植物油的掺伪。因此，需要一种更有效、可量化的鉴定方法用于鉴别橄榄油等级，为橄榄油市场提供保障。元素的定量测定已被广泛用于鉴别有机食品和食品的地理来源，它们具有丰富的营养[11]、安全性[12]和质量影响[13]。Benincasa等[14]通过电感耦合等离子体质谱法对意大利不同地区的初榨橄榄油进行多元素分析，研究发现，大多数检测的元素在不同地区样品中显示出明显的差异，并结合适当的统计分析实现了良好区分。Wu Hao等[15]采用同位素和多元素含量分析对我国进口红酒进行产地判别，建立了一种可靠的红酒产地溯源方法。已有先前研究采用化学计量学在食品产地溯源[16-21]、品质鉴别[22-23]、掺假鉴别[24-25]等领域广泛应用。利用主成分分析（principal component analysis，PCA）、层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）及正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等化学计量学方法建立相应的数据库和鉴别模型，成为橄榄油掺伪鉴别技术研究的主攻方向[26-31]。

目前鲜有报道基于多元素含量分析结合化学计量学技术对橄榄油等级进行鉴别。因此，本实验提出了一种采用电感耦合等离子体原子发射光谱（inductively coupled plasma optical emission spectroscopy，ICP-OES）仪、电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）仪定量分析橄榄油中53种元素，结合化学计量学的方法对特级初榨橄榄油和精炼橄榄油进行鉴别，并找出两种等级橄榄油间具有显著差异的特征性元素，旨在为橄榄油掺伪及等级鉴别提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

已确认属性的样品共34种，包括18种特级初榨橄榄油和16种精炼橄榄油，均收集于进口及国内外各橄榄油企业，经相关机构认定及实验证明其真实属性，样品编号及真实属性等信息见表1；98种未知属性的橄榄油样品作为测试集。

表1 实验样品信息Table 1 Information of olive oil samples used in this study

Ir、Pt、Au、Ag、V、Co、Te、Rb、Ru、Cs、As单元素标准溶液的质量浓度为1 000 mg/L，由美国o2si公司提供；Na、Li、Al、Ti、Sn、Mo、Se、Sr、Mn、Cu、Cd、Ca、K、P、Mg、Sb、Fe、Ni、Hg、Pb、Zn、Ba、Cr、Rh、Tl单元素标准溶液以及Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yd、Ln这17种稀土多元素混合标准溶液的质量浓度为1 000 mg/L，内标元素贮备液（1 000 mg/L）Sc、In、Rh、Bi，均由国家有色金属和电子材料分析测试中心提供。

硝酸（优级纯）；氩气（≥99.995%）；氦气（≥99.995%）。

1.2 仪器与设备

7900 ICP-MS仪、5100 ICP-OES仪 美国Agilent公司；XPE26C电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；TOPEX微波消解仪 上海屹尧仪器公司；Million-Q Integral型超纯水系统 德国默克公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取约0.5 g（精确至0.001 g）样品于微波管中，加入5 mL硝酸进行消解，120 ℃消化5 min，150 ℃消化10 min，190 ℃消化20 min。然后取出消化物，冷却至室温，消解之后的样品转移至25 mL或50 mL离心管中，用适量超纯水洗涤消解罐3次，洗涤液倒入离心管中，用水稀释至刻度，混匀，即为待测试样。每组样品平行测定3次，同时作试剂空白溶液。

1.3.2 测定条件

Na、K、Mn、P、Zn、Ca、Fe、Mg含量通过ICP-OES测定，其余元素通过ICP-MS测定，按照GB 5009.268ü2016《食品中多元素的测定》中规定的方法进行分析。

ICP-MS条件：功率1 500 W；载气流量0.8 L /min；等离子体气流量15 L/min；辅助气流量0.40 L/min；氦气流量4～5 mL/min；雾化室温度2 ℃；样品提升速率0.3 r/s；采样深度8～10 mm。

ICP-OES条件：功率1 150 W；等离子气流量15 L/min；辅助气流量0.5 L/min；雾化气流量0.65 L/min；泵速50 r/min。

1.4 数据预处理及化学计量学分析

采用SPSS 24.0软件对测得的数据进行预处理、独立样本t检验以及箱型图的绘制。数据预处理方式包括：1）检出限的一半替换空值；2）检出限的一半替换空值后取log2值；3）检出限的一半替换空值后，进行Z-score化处理。数据进行预处理后导入到Metaboanalyst软件中进行PCA、OPLS-DA和HCA。用SIMCA14.0软件进行置换检验及外部验证验证模型的可靠性。将数据导入OmicShare软件进行差异倍数的计算。

2 结果与分析

2.1 两种等级橄榄油的多元素含量测定结果

本研究测定了特级初榨橄榄油和精炼橄榄油样品中53种元素含量，结果表明，其中31种元素含量低于方法检出限，其余22种元素在两种等级橄榄油中经过统计的平均值和标准偏差如表2所示，数据显示，Cu、Fe在特级初榨橄榄油和精炼橄榄油中含量的平均值分别为51.389 μg/100 g、0.636 mg/100 g和197.075 μg/100 g、1.604 mg/100 g，据相关文献报道，可能是由于精炼过程而导致这两类金属含量的升高[32]；Sc和La在特级初榨橄榄油中含量的平均值为0.593 mg/kg、6.780 μg/kg，显著高于精炼橄榄油中含量的平均值0.370 mg/kg、4.360 μg/kg，有文献研究发现，稀土元素在橄榄油中的含量与生产过程有关，同时据报道，稀土元素还与土壤中的原始分布及橄榄树的代谢有关[33]。因此，这两种元素还需后续进一步考察，在本研究中作为参考指标结合其他元素进行综合判定。

表2 22种元素在两种等级橄榄油中的含量（±s）Table 2 Concentrations of 22 elements in two grades of olive oil (x ± s)

表2 22种元素在两种等级橄榄油中的含量（±s）Table 2 Concentrations of 22 elements in two grades of olive oil (x ± s)

元素 含量特级初榨橄榄油 精炼橄榄油V/（mg/kg） 0.003f0.001 0.004f0.001 Co/（mg/kg） 0.002f0.001 0.002f0.002 Ag/（mg/kg） 0.273f0.272 0.102f0.130 Ca/（mg/100 g） 13.036f9.986 12.850f11.070 Cu/（μg/100 g） 51.389f30.331 197.075f45.237 Fe/（mg/100 g） 0.636f0.231 1.604f0.260 K/（mg/100 g） 7.018f1.335 7.821f1.705 Mg/（mg/100 g） 7.403f1.428 7.346f0.881 Mn/（μg/100 g） 35.917f32.140 66.988f66.765 Na/（mg/100 g） 1.629f0.697 1.597f0.707 Zn/（mg/100 g） 0.753f0.244 0.340f0.021 Ti/（mg/kg） 0.013f0.009 0.013f0.006 Ni/（mg/kg） 0.324f0.840 0.288f0.416 Sr/（mg/kg） 0.116f0.082 0.089f0.044 Al/（mg/100 g） 6.280f2.833 22.812f3.233 Li/（mg/kg） 0.180f0.173 0.331f0.216 Ba/（mg/kg） 0.180f0.162 0.490f0.204 Sc/（mg/kg） 0.593f0.040 0.370f0.057 Y/（μg/kg） 1.170f0.830 1.500f1.670 La/（μg/kg） 6.780f0.808 4.360f1.027 Ce/（μg/kg） 5.508f6.700 3.447f4.315 Dy/（μg/kg） 0.312f0.272 0.408f0.399

2.2 两种等级橄榄油鉴别的化学计量学分析

2.2.1 PCA

PCA通过对错综复杂的数据进行降维，筛选能重现的数据信息，并以几个PC的形式对原始数据进行可视化，可以集中典型地表征原变量的数据特征，从而充分反映总体信息[34-35]。为观察样品的聚类情况及是否存在离群点，对18种特级初榨橄榄油及16种精炼橄榄油中检测到的22种元素进行PCA，图1A～C为采用不同数据预处理方法得到的22种元素鉴别两种等级橄榄油的PCA得分图，结果表明，在3种数据预处理方式中，检出限的一半替换空值，Z-score化处理得到的PCA得分图可以对两种等级橄榄油明显区分。因此，此数据预处理方法是最有效的一种。图1D反映了引起两种等级橄榄油差异的关键变量，其中，Al、Fe、Cu、V、Ba在载荷图的位置与精炼橄榄油在得分图的位置相似，说明与其呈正相关；同理，Sc、Zn、La与特级初榨橄榄油呈正相关。这与表2结果一致。

图1 2种橄榄油等级鉴别的PCA得分图及载荷图Fig.1 PCA score and loading plots for grade identification of two grades of olive oil

2.2.2 HCA

如图2所示，基于22种元素通过HCA，样品清晰地分为两组，并且都被正确分类。上述研究结果表明，可以通过HCA成功区分特级初榨橄榄油和精炼橄榄油。

图2 基于22种元素对两种等级橄榄油鉴别的HCA热图Fig.2 Heat map obtained by cluster analysis of two grades of olive oil based on 22 elements

2.2.3 OPLS-DA

为在两种等级橄榄油间获得更好的分类，建立了OPLS-DA模型，R2X代表建模时，在X轴方向模型的解释率（即在X轴方向保留原始数据信息百分比的平方）；R2Y代表建模时，在Y轴方向模型的解释率；Q2代表模型的可预测能力，通过交叉验证得到，Q2大于0.5，说明该模型预测能力良好[29]。理论上，R2、Q2数值越接近于1说明模型的预测能力及拟合准确度越高。两种等级橄榄油鉴别的OPLS-DA模型如图3A所示，此模型可以对特级初榨橄榄油及精炼橄榄油进行明显区分，样品组内可得到较好的聚类分离效果。OPLS-DA 模型数值为R2X=0.545，R2Y=0.959，Q2=0.9，表明模型的解释及预测能力良好，两种等级橄榄油可进行有效鉴别。此外，进行外部验证以进一步评估基于测试样品验证模型的准确性，测试样品包括98个未知属性的橄榄油样品，结果显示只有个别测试样品被错误分类，94个样品分类和原有标识一样，准确率高达96%，说明建立的OPLS-DA模型可靠。OPLS-DA模型产生的载荷图可用于筛选对两组样本组间分类有贡献的变量，离原点越远的点则对分类越有贡献，如图3B所示，Sc、La、Zn、Al、Fe、Cu对模型的贡献较大。

图3 两种等级橄榄油鉴别的OPLS-DA模型（A）及载荷图（B）Fig.3 OPLS-DA model (A) and loading plot (B) for the identification of two grades of olive oil

OPLS-DA作为有监督的模式判别模型，具有一定的数据过拟合风险，因此，需要对建立的模型进行置换检验。置换检验是将样品的分组标记随机打乱，对样品进行顺序置换，从而重新进行建模和预测的过程，一般置换检验次数设置为200次。作为一个可靠的有监督模型，Q2回归线在y轴上的截距要小于0。置换检验结果如图4所示，R2回归线在y轴上的截距为0.339；Q2回归线在y轴上的截距为-0.413，明显小于0，这也表明所建立的OPLS-DA模型可靠。

图4 OPLS-DA模型的200次置换检验Fig.4 Validation of OPLS-DA model by 200 permutation tests

2.3 特征性元素的确定

图5表示OPLS-DA模型得到的变量权重重要性排序（variable importance for the projection，VIP），VIP是指贡献变量影响的所有模型维度上的总和。通常认为VIP≥1的变量是模型的重要变量。VIP值越大，说明该变量在判别过程中贡献越大，在两组样品间的差异越显著，从图5可以看出，有8种元素VIP≥1，可作为区分特级初榨橄榄油和精炼橄榄油的重要变量。通过SPSS 24.0软件对预处理后的数据进行t检验，P＜0.05表示具有显著差异。将数据导入OmicShare软件进行差异倍数（fold change，FC）的计算，FC即某个代谢物在两组间表达量的差异倍数。最终以VIP≥1、FC＞2和P＜0.05为条件进行两种等级橄榄油的特征性元素筛选，结果如表3所示，Al、Fe、Cu、Ba、V、Sc、La、Zn在特级初榨橄榄油和精炼橄榄油的等级鉴别中起着重要作用，得到的8种特征性元素在两种等级橄榄油中相对含量差异的箱型图如图6所示。

图5 OPLS-DA模型的VIP值Fig.5 VIP values of OPLS-DA model

表3 区别两种等级橄榄油的特征性元素Table 3 Characteristic elements to distinguish two grades of olive oil

图6 8种元素在两种等级橄榄油中的箱型图Fig.6 Box plots of eight elements in two grades of olive oil

3 结 论

采用ICP-MS和ICP-OES的方法基于多元素含量分析结合化学计量学技术成功区分了特级初榨橄榄油和精炼橄榄油。与特级初榨橄榄油相比，Fe、Cu在精炼橄榄油中的含量显著增多，这可能是因为橄榄油的精炼过程导致；而Sc、La在精炼橄榄油中含量显著降低，由于稀土元素的含量受品种、土壤等环境的影响，所以精炼过程对稀土元素的影响还有待后续进一步考察。预处理方式中，检出限的一半替换空值，Z-score化处理所得到的PCA得分图效果最佳。进一步对两种等级橄榄油进行了聚类分析，聚类效果明显，且两种等级橄榄油都被正确分类。所建立的OPLS-DA模型聚类区分度良好，具有良好的解释及预测能力，可对两种等级橄榄油进行有效鉴别。根据VIP值、FC和P值，筛选出Al、Fe、Cu、Ba、V、Sc、La、Zn为区分两种等级橄榄油的特征性元素。结果证明，基于多元素含量分析结合化学计量学技术可以作为鉴别两种等级橄榄油有效手段，为橄榄油真实性鉴别提供了坚实理论和科学依据。