姚元谦，刘英，杨玉雯，吕建林，黄晶晶

(1.广西中医药大学， 广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院， 广西 南宁 530023)

0 引言

肝癌的类型主要为肝细胞性肝癌(75%～85%)，其晚期患者比例大、肝病背景复杂、复发率高的特点是影响肝癌患者治疗及预后的重要因素[1]。目前对于肝癌的治疗仍是临床难题，尽管近年来开发了多种肝癌的新疗法，尤其是靶向治疗，虽然增加了肝癌患者的总生存期，但仍达不到临床所期望的疗效[2]。

铁死亡是一种新发现的细胞程序性死亡形式，主要由铁介导的氧化损伤、过度脂质氧化和细胞膜损伤驱动[3]。越来越多证据表明，诱导肿瘤细胞铁死亡在各种癌症治疗中具有重要作用，尤其是针对传统治疗效果欠佳的恶性肿瘤患者[4-5]。中医药医治肿瘤有着悠久的历史，疗效确切，中西医联合治疗能够减少西药毒副作用，降低术后复发率，延缓病情进展，在肿瘤防治上具有不可忽视的重要作用[6-7]。目前对于中药调节铁死亡的研究处于起步阶段，部分研究表明有多味中药及中药复方能够调节铁死亡，发挥抗肿瘤活性[8]。

本文中运用生物信息学、系统药理学，以铁死亡相关靶点为切入点，整合靶点-化合物-中药的复杂调控网络，分析可作用于肝癌铁死亡靶点的化合物、中药及用药规律，以期为后续调控铁死亡的中药研究及药物开发提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 靶点收集及靶点机制分析

从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov)下载肝细胞癌的转录组表达数据，从FerrDb数据库(http://www.zhounan.org/ferrdb)下载铁死亡相关靶点，运用R软件提取转录组数据中铁死亡相关靶点的表达量，使用R包“limma”对肝癌组及癌旁组样本进行差异分析，以|logFC|>1、FDR<0.05为过滤条件，筛选出肝癌中具有显著性差异的铁死亡靶点。使用R包“clusterProfiler”对差异靶点进行基因本体(gene ontology，GO)和京都基因组基因百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG)富集分析。

1.2 候选化合物筛选及靶点-化合物网络构建

通过检索Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)匹配各靶点全称，将靶点全称依次提交至TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)，收集所有可匹配到的化合物，并记录各化合物的分子信息和药代动力学参数，以ADME参数和Lipinski规则为过滤条件筛选出候选化合物[9]，具体条件为：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug-likeness，DL)≥0.18，半衰期(half-life，HL)>4，拓扑极性表面积(topological polar surface area，TPSA)<140，可旋转键数(number of rotatable bonds，RBN)≤10，分子量(molecular weight，MW)≤500 Da。运用Cytoscape3.9.0软件构建潜在靶点-候选化合物网络，对网络节点进行拓扑分析，初步预测中药调节铁死亡治疗肝癌的关键化合物。

1.3 中药获取及用药规律分析

通过TCMSP收集与潜在化合物相关联的中药，将收集的中药与《中华人民共和国药典》《中国临床药物大辞典》进行信息匹对，未收录的中药则剔除。将中药数据导入中医传承计算平台V3.0软件，选择数据分析模块下的统计分析及方剂分析功能，进行中药的四气、五味、归经、功效、频次分析。使用Cytoscape软件构建中药-化合物-靶点网络。

1.4 候选化合物-靶点分子对接

为了进一步验证化合物与潜在靶点之间的结合可信度，选取1.2节的潜在靶点-候选化合物网络中，度值前4位的化合物作为小分子配体，以各潜在靶点作为蛋白受体进行分子对接验证。从TCMSP数据库下载化合物的MOL2结构文件，从PDB数据库(https://www.rcsb.org)下载蛋白受体的pdb结构文件，使用PyMOL软件删除蛋白受体的水分子及配体，运用AutoDockTools1.5.6软件将MOL2文件及pdb文件转换为pdbqt文件，并确定蛋白受体的活性口袋，最后通过AutoDock Vina软件进行分子对接。

2 结果

2.1 肝癌中铁死亡差异表达靶点

从TCGA获取424个转录组数据，其中肝细胞癌组织374例、正常癌旁组织50例，从FerrDb收集382个铁死亡相关靶点，与转录组数据取交集后，最终纳入246个铁死亡靶点。对肝癌组及正常组进行差异表达分析，有84个靶点在肝癌中具有表达差异，其中在肝癌组上调基因71个、下调基因13个。246个铁死亡靶点差异表达火山图如图1所示。

图1 246个铁死亡靶点差异表达火山图Fig.1 Volcano plot of differential expression of 246 ferroptosis targets

2.2 铁死亡差异表达靶点机制

应用R软件对差异靶点进行富集分析,84个铁死亡差异靶点富集分析如图2所示，结果得到生物学进程(biological process，BP)条目631条，主要包括细胞对化学应激的反应、氧化应激反应等生物进程；得到细胞组分(cell component，CC)条目22条，主要在细胞顶端、色素颗粒等处发挥作用；得到分子功能(molecular funtion，MF)条目77条，主要包括氧化还原酶活性、铁离子结合等；得到信号通路87条，主要富集在铁死亡、花生四烯酸代谢、VEGF、MAPK、mTOR等信号通路上。

图2 84个铁死亡差异靶点富集分析Fig.2 Enrichment analysis of 84 differential targets of ferroptosis

2.3 候选化合物及靶点-化合物网络

通过TCMSP检索84个差异靶点，有27个靶点可匹配到化合物，总共关联到767个化合物，根据ADME参数和Lipinski规则共筛选出103个化合物，分别对应13个铁死亡靶点，靶点信息详见表1。故以这103个化合物作为候选化合物，其对应的13个靶点作为潜在靶点，构建靶点-化合物网络，候选化合物-潜在靶点网络图如图3所示，该网络由118个节点、110条边构成，其中关联靶点最多的化合物有MOL000098(quercetin，槲皮素)、MOL004328(naringenin，柚皮素)、MOL001558(sesamin，芝麻素)、MOL013179(fisetin，漆黄素)，其度值分别为4、3、2、2。而关联度值最高的靶点有NOS2、IL6、DRD4、NQO1、MAPK3。

图3 候选化合物-潜在靶点网络图Fig.3 Candidate compound-potential target network diagram

表1 铁死亡干预肝癌的潜在作用靶点Tab.1 Potential targets of ferroptosis intervention for liver cancer

2.4 中药匹配及靶点-化合物-中药网络

通过TCMSP收集候选化合物可关联到的中药，经与《中华人民共和国药典》《中国临床药物大辞典》匹配后，共获得277味中药，累计出现692次。为了进一步分析潜在靶点、候选化合物和可关联中药的内在联系，故构建三者的连线网络，潜在靶点-候选化合物-可关联中药网络如图4所示。该网络由395个节点、867条边构成。对该网络进行拓扑分析发现，中药关联度值>7的有12味，通过候选化合物-潜在靶点的桥接作用显示，中药关联靶点数>7的有11味，调节铁死亡中药的化合物和靶点数如图5所示。提示这些中药可能在铁死亡干预肝癌中发挥重要作用，后续可作为中药调节铁死亡的研究依据。

图4 潜在靶点-候选化合物-可关联中药网络Fig.4 Potential target-candidate compound-associable TCM network

图5 调节铁死亡中药的化合物和靶点数Fig.5 Number of compounds and targets of TCM regulating ferroptosis

2.5 关联中药性味归经功效

将可关联中药数据导入中医传承计算平台进行用药规律分析，结果见表2和图6。可以看出，中药性味以寒性、温性、苦味、辛味使用为主，归经方面以肝、肺、脾胃经应用最多，功效方面以清热解毒药、补虚药、活血化瘀药运用为主。

表2 调节铁死亡中药的性味归经Tab.2 Regulating the taste of TCM for ferroptosis

图6 调节铁死亡中药的功效分布Fig.6 Efficacy distribution of TCM for regulating ferroptosis

2.6 分子对接验证

选取2.3节化合物-靶点网络中的主要化合物作为配体，分别为槲皮素、柚皮素、芝麻素、漆黄素，将13个潜在靶点作为蛋白受体，其中CAV1靶点未被PDB数据库收录，故予以剔除。一般认为结合能小于-4.25 kcal/mol则配体与靶点受体之间有结合活性；结合能小于-5.0 kcal/mol，表明匹配活性较佳；结合能小于-7.0 kcal/mol，提示具有强烈的对接活性[10]。分子对接热图如图7所示，48组对接得分均小于-4.25 kcal/mol，最低得分为-5.9 kcal/mol(HSF1-槲皮素)，最高得分为-11.4 kcal/mol(AKR1C1-芝麻素)平均得分为-8.38 kcal/mol，表明筛选出的靶点与化合物间具有较好的匹配度，也从侧面证明本次构建的靶点-化合物-中药网络具有一定的可靠性。选取部分对接结果进行展示，见图8。

图7 调节铁死亡的核心化合物-潜在靶点分子对接热图Fig.7 Heatmap of docking of core compound-potential target molecules regulating ferroptosis

(a) NOS2-槲皮素

(b) NQO1-柚皮素

(c) AKRIC1-芝麻素

(d) MAPK3-漆黄素

3 讨论

程序性细胞死亡是生物学和医学领域的研究热点，靶向细胞死亡进程中的节点是癌症治疗中的常见方法。铁死亡作为一种新的程序性细胞死亡过程，具有独特的死亡机制，在肿瘤治疗中显示出巨大的潜力。研究表明，在中药里存在调节铁死亡的活性成分，多味药物进行组方时，可能同时作用于多个铁死亡靶点，与传统的铁死亡诱导制剂相比，中药具有疗效可靠、安全性高、制备配伍合理等优势。

通过差异分析发现，在肝癌组织和癌旁组织中，有84个铁死亡靶点存在表达差异，其中有14个靶点差异最显著(|logFC|>3)，部分靶点已被证实参与铁代谢过程或肿瘤的调节。NQO1在细胞内起到抗氧化作用，其表达水平受Nrf2信号通路调控[11]，研究发现NQO1在肝癌患者中处于高表达，且与患者生存时间呈负相关[12]。SLC7A11参与胱氨酸转运蛋白Xc-系统，通过介导胱氨酸摄取和谷氨酸释放促进谷胱甘肽合成，以抑制细胞氧化应激反应，其在多种恶性肿瘤中过表达，从而抑制铁死亡，促进肿瘤发展[13-14]。HAMP是维持体内铁代谢稳态的关键基因，其转录产生的铁调素能与铁外排蛋白(FPN)结合并溶解，从而减少铁进入外周循环，当HAMP表达下调时可抑制细胞发生铁死亡[15]。G6PD能维持谷胱甘肽的还原型以起到细胞的抗氧化损伤作用，其在体内的激活或过表达能促进肝癌细胞的生成、增殖及迁移[16-17]。通过文献检索证实，此研究得出的铁死亡差异靶点具有可信性，其在铁死亡及肝癌的发生发展中有一定的调控作用。

富集分析显示，预测概率最高的通路为铁死亡通路，再次佐证了次此分析差异靶点的可信性，此外还有VEGF、mTOR、HIF-1等信号通路。VEGF(血管内皮生长因子)在多数肿瘤患者中呈高表达，能促进血管生成及肿瘤细胞的增殖，作为VEGF抑制剂的索拉非尼，近10年来一直是治疗晚期肝癌的一线用药[18]。mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)在调节细胞生长、代谢和蛋白质合成中有着重要作用，mTOR信号传导常在肿瘤环境中被过度激活，通过调节代谢过程为肿瘤细胞提供营养物质，同时能抑制细胞自噬而促进肿瘤细胞增殖[19-20]，目前已有多种治疗癌症的mTOR抑制剂上市，治疗肝癌的第一代mTOR抑制剂未能取得满意疗效，第二代mTOR抑制剂能够同时抑制mTORC1/2而降低耐药性，当前更多有效的mTOR抑制剂正在开发中[21]。

构建靶点-化合物网络发现，在调控铁死亡干预肝癌的化合物中，槲皮素、柚皮素、芝麻素和漆黄素可能发挥着关键作用[22-23]，研究发现以上4种化合物均能参与细胞氧化代谢过程。如槲皮素能够在癌细胞中，诱导转录因子TFEB介导的溶酶体活化，进而促进铁蛋白的降解，从而导致铁死亡和细胞凋亡[24]，槲皮素可以抑制肝癌细胞的增殖、转移并增加化疗药物的敏感性[25]。以上研究表明中药具有调节铁死亡的能力，此研究的4种化合物与铁死亡机制相关联，具备成为调节剂的药物开发价值。

在靶点-化合物-中药网络中，关联度值最高的中药有半枝莲、甘草、黄芩、菊花、丹参等，而关联靶点数最高的中药有菊花、麻黄、银杏子、菟丝子等。半枝莲、菊花均具有广泛的抗肿瘤、抗炎等生物活性，在治疗肝癌上有良好效果，且研究发现菊花能够诱导肿瘤细胞凋亡[26-27]。中药用药规律分析显示，调节铁死亡治疗肝癌的中药以寒温平、苦辛甘运用为主。多用寒性药能清热解毒，而使用温性药一方面能制约寒药攻邪太过，另一方面能起到温运痰湿、暖肝温脾的功效；辛味力行气血，散腹中积聚肿块、载药通达经脉阻滞之处；苦味能泻能燥，能清泻湿热、化解瘀毒；甘味能补，补益人体正气、恢复脏腑功能。正如《素问·脏气法时论》所述：“辛散，酸收，甘缓，苦坚，咸软……此五者，各有所利，或散或收，或缓或急，或坚或软”。这也与中医对肝癌的病机认识相符合，在《原发性肝癌中西医结合诊疗专家共识》[28]中指出，本病总属本虚标实、虚实夹杂，毒、瘀、虚是肝癌总的病机概括，其互为因果，恶性循环，贯穿肝癌全程。

中药归经分析表明，以肝、肺、脾胃、肾经药物运用为主。一方面，本病的病位在肝脏，以入肝经药物使用为主符合用药规律；另一方面从现代医学的角度看，肝脏具有生物转化、脂质代谢的作用，氧化代谢是生物转换的重要环节之一，肝脏也是转铁蛋白、载脂蛋白等血清蛋白的主要合成场所，同时肝脏也是铁离子的主要储备器官，以上几点都与诱发铁死亡的因素有关。虽然中西医对于“肝”的定义不全相同，但从此研究结果来看，运用入肝经的中药来调节铁死亡干预肝癌，可能更易诱导肿瘤细胞死亡而起到更好的治疗效果。除肝经外，肺经药物使用较多，肝主疏泄、调节及储存血液，肺主宣发、肃降、朝百脉，肝肺气机升降相宜，则全身气血运行调和。从中药的功效运用来看，以清热解毒类、补虚类、活血化瘀类等为主，正如《医林改错》言：“肚腹结块者，必有形之血”，《医宗必读》指出：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”，可以看出，调节肝癌细胞铁死亡的中药能够补益人体正气、祛癌毒邪气、散气血积滞。

综上所述，本次研究以铁死亡为切入点，系统分析了铁死亡在肝癌中的作用机制，及使用中药进行干预的用药规律。研究结果表明，中药能够有效调节铁死亡干预肝癌进展，且用药规律符合当代医家对肝癌的病机认识，希望能为中药调节铁死亡的后续研究提供新视角。同时本研究也存在一定的不足，如未考虑药物的量效关系、临床影响因素等。