何晓光，赵 君，李 娜

(合肥市口腔医院 安徽医科大学合肥口腔临床学院 药剂科，安徽 合肥 230001)

牙周膜干细胞是牙周组织中的成体干细胞，具有多向分化的潜能，其骨向分化能力在牙槽骨的改建过程中起着重要的作用[1]，研究[2]表明炎症状态下人牙周膜干细胞的骨向分化能力减弱，可能是通过NF-κB信号通路影响了其骨向能力的改变，从而解释了临床上牙周炎患者牙槽骨流失速度过快的原因。革兰阴性菌是牙周炎患者最常见的致病菌，其细胞壁的主要成分脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是一种重要的炎症诱导因子，可以通过激活Toll样受体4的表达促发炎症因子的转录，形成炎性微环境[3-4]。

在一些炎症性疾病、自身免疫性反应和过敏性反应的临床给药中，地塞米松(Dexamethasone，Dex)作为糖皮质激素的代表之一被广泛使用[5-6]。研究[7-8]显示，Dex能够下调多条炎症相关通路的表达，包括NF-κB通路，从而发挥其抑制炎症反应、激活改善炎症环境等作用，而在牙周炎中Dex是否可以通过抑制NF-κB信号通路减缓牙周膜干细胞的炎性表达，从而达到促进成骨的目的是本研究拟探究的关键问题。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器 0.1%茜素红及Dex，美国Sigma公司；牛血清白蛋白、α-MEM培养液、LPS，美国Abcam公司；CO2恒温孵育箱，美国Thermo公司；超净工作台，中国苏州设备净化有限公司；体式显微镜及倒置相差显微镜及照相系统，日本OLYMPUS公司；酶联免疫检测仪，美国BIO-TEK公司；Real-time PCR仪，美国Applied Biosystems公司；细胞计数仪，中国Countstar公司。

1.2 取材 离体牙取材于合肥市口腔医院因正畸拔除的患者，年龄14～20岁。取材前征得患者及家属知情同意，要求患者无全身性疾病，牙周组织健康。

1.3 牙周膜干细胞的分离培养和纯化 本课题组借鉴牙周膜干细胞分离培养的方法[2-3]并加以改良，采取消化法(60 min)结合组织块贴壁法培养牙周膜细胞，细胞爬出后7～10 d传代。取对数生长期的第1代细胞进行纯化，将细胞进行低密度接种，出现细胞克隆集落后常规传代培养。

1.4 多向分化潜能鉴定 分别对低密度克隆化培养的牙周膜细胞进行成骨、成脂诱导，进行干细胞多向分化潜能的鉴定，培养21 d后分别用茜素红、油红O对其进行钙化结节与脂滴的染色。

1.5 实验分组 将第3代细胞随机分为4组，正常对照组为正常培养液培养的牙周膜细胞；Dex组为含Dex终浓度为1×10-8mol/L 培养液培养的牙周膜细胞、LPS组为10 μg/mL LPS刺激的牙周膜细胞，Dex+LPS组为同时含有1×10-8mol/L Dex和10μg/mL LPS培养液培养的牙周膜细胞。

1.6 Elisa检测炎症因子IL-6表达水平 分别于24 h后收集正常组、Dex组、LPS组及Dex+LPS组的培养液，Elisa试剂盒检测培养液中IL-6的表达水平，酶标仪450 nm波长读取光密度值，制作标准曲线，计算出各组IL-6的含量。

1.7 茜素红染色 将培养21 d的4组细胞弃上清液，PBS清洗2遍控干后4%多聚甲醛固定10 min。弃固定液PBS冲洗，加入1%茜素红染液染色，20 min后PBS洗净，倒置相差显微镜观察。

1.8 Real-time PCR检测各组细胞骨向分化诱导后RUNX-2、OPN、ALP表达 将各组细胞培养7 d后利用Trizol试剂盒mRNA，酶标仪测定mRNA纯度及浓度，按照逆转录试剂盒方法逆转录形成cDNA。qRT-PCR检测骨相关基因RUNX-2、OPN、ALP的相对表达量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

1.9 Western blot检测各组细胞核蛋白中p65的表达水平 收集4组细胞，吸取培养液控干培养瓶，用预冷的PBS清洗2遍并控干，利用核蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白，过程中注意冰上操作，电泳转膜后用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入p65一抗，4℃环境下孵育过夜。洗膜后加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST洗涤4次，每次8 min，ECL化学发光试剂曝光显影。采用Image J软件分析条带灰度值，计算各目的蛋白与GAPDH灰度值的比值。

表1 引物序列

2 结果

2.1 人牙周膜干细胞培养与鉴定 常规培养液培养7 d左右观察到细胞从组织块周围爬出，多成长梭形(图1A)，取对数生长期的第1代细胞低密度接种进行纯化，镜下可见克隆集落形成(图1B)，消化克隆细胞进行常规传代培养,并对其进行干细胞多向分化潜能的鉴定，成脂、成骨诱导21 d后分别可见形成脂滴(图1C)和钙化结节(图1D)。

A.组织块周围有细胞爬出；B.低密度接种后克隆集落形成；C.成脂诱导21d后脂滴形成；D.成骨诱导21d后钙化结节形成。

2.2 Elisa检测各组细胞炎症因子IL-6表达水平 结果显示，LPS组IL-6表达水平高于正常对照组(P<0.05)，提示LPS诱导炎症反应产生，Dex+LPS组IL-6表达水平较LPS组减轻(P<0.05)，提示Dex起到了抗炎作用，见表2。

表2 各组细胞IL-6表达水平

2.3 茜素红染色观察各组细胞钙化结节形成情况 将各组细胞培养21 d后，茜素红染色观察钙化结节形成情况，正常对照组(图2A)、LPS组(图2C)未见明显钙化结节产生，Dex组钙化结节明显可见(图2B)，Dex+LPS组钙化结节明显较LPS组多，较Dex组少(图2D)，提示Dex可改善炎症状态下牙周膜干细胞骨向分化的能力。

2.4 Dex对LPS刺激下牙周膜干细胞骨基因ALP、RUNX-2、OPN mRNA表达的影响 结果显示，Dex组与Dex+LPS组骨相关基因ALP、RUNX-2、OPN mRNA表达量均较正常对照组上调(P<0.05)；Dex+LPS组骨相关基因ALP、RUNX-2、OPN mRNA表达水平均较LPS组增加(P<0.05)，见表3。

A.正常对照组；B.Dex组；C.LPS组；D.Dex+LPS组。

表3 各组细胞基因ALP、RUNX-2、OPN mRNA表达情况

2.5 NF-κB信号通路关键分子p65核蛋白表达水平 结果显示，LPS组p65核蛋白表达量升高(P<0.05)，提示LPS刺激的炎症反应激活了NF-κB信号通路，而Dex+LPS组p65核蛋白表达量较LPS组降低(P<0.05)，提示Dex可能抑制了NF-κB信号通路，见图3。

A.各组p65核蛋白表达；B.p65核蛋白与GAPDH灰度值的比值。*P<0.05 vs. 正常对照组(N)；#P<0.05 vs. LPS组

3 讨论

牙周炎是一种炎症性、破坏性疾病，是由牙菌斑导致的牙周附着结构的破坏，是成人牙齿丧失的首要原因。我国是牙周病的高发国家，根据我国第四次全国口腔流行病学调查研究资料显示：中年人群的牙周炎患病率随着年龄的增长而逐渐升高，发展到老年人群的失牙率和无牙颌率居高不下[9]。牙周炎致病菌细胞膜外的LPS可通过Toll样受体4介导炎症反应的发生，在本研究中，课题组选用LPS刺激人牙周膜干细胞，并检测了炎症因子IL-6的表达，模拟了牙周炎的炎性微环境，并在此基础之上探讨了Dex的抗炎作用以及对人牙周膜干细胞成骨的影响，研究结果显示，LPS刺激后加入Dex能明显降低炎症因子的表达，并可上调成骨相关基因ALP、RUNX-2、OPN mRNA表达水平，提示Dex在一定程度上恢复了炎症状态下牙周膜干细胞的功能，从而达到减缓牙槽骨的丧失改善牙周健康的目的。

Dex是临床上使用最广的一种糖皮质激素，具有抗病毒、抑制炎症及免疫应答、抗休克作用。糖皮质激素在口腔临床治疗中可以辅助用于口腔黏膜疾病、牙周牙髓联合病变、下颌埋伏阻生智齿拔除术以及牙拔除术后的抗感染、防止干槽症等方面，研究表明Dex可以减轻炎症介导的对血管内皮细胞的抑制作用[10]，亦可抑制人肺上皮细胞炎症反应[11]。本研究中，课题组研究了牙周膜干细胞在不同刺激因素下NF-κB信号通路中关键分子p65核蛋白表达水平，结果发现LPS刺激下人牙周膜干细胞p65核蛋白表达水平明显增高，提示NF-κB信号通路被激活，而加入Dex后p65核蛋白表达水平降低，NF-κB信号通路被抑制，成骨相关基因表达上升，提示Dex可能通过抑制炎症信号通路NF-κB从而促进人牙周膜干细胞的成骨分化，但本研究尚未对p65上游分子进行研究，亦没有建立牙周炎动物模型验证Dex的治疗效果，这也为后续的研究提供了思路。