伍健缤 陈坤豪 陈木溪 陈长明

摘要：芸薹属蔬菜种质资源丰富，是中国蔬菜产业的重要组成部分。游离小孢子培养是创造单倍体和双单倍体的重要途径，对提高芸薹属蔬菜的育种效率具有重要意义。为了研究芸薹属蔬菜游离小孢子的高效培养体系，归纳了植物材料、预处理方式、培养基成分、培养密度、高温热激、植株再生、植株的倍性鉴定与加倍等多个因素对小孢子培养的影响，提出了可通过优化培养体系、遗传转化和共培养等方式提高芸薹属蔬菜小孢子培养效率的观点。

关键词：芸薹属蔬菜;游离小孢子;胚胎发生;植株再生;双单倍体;育种

中图分类号： S603.6     文献标志码：A     论文编号：cjas2020-0172

Isolated Microspore Culture ofBrassica Vegetables： A Review

WU Jianbin ， CHEN Kunhao123，， CHEN Muxi2，3， CHEN Changming1

（1College ofHorticulture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， Guangdong， China;2Guangdong Helinong Seeds， CO.， LTD.， Shantou 515800， Guangdong， China;3Guangdong Helinong Agricultural Research Institute， CO.， LTD.， Shantou 515800， Guangdong， China）

Abstract： Brassica vegetable is rich in germplasm resources and has very important role in China’s vegetable industry. Isolated microspore culture is a considerable way to create haploid and double haploid， and is significant to improve the breeding efficiency of Brassica vegetables. In order to study the efficient culture system of isolated microspore of Brassica vegetables， the effects of plant materials， pretreatment methods， medium composition， culture density， heat shock， plantlet regeneration， ploidy identification and diploid inducement on microspore culture were summarized. It is proposed that the efficiency of isolated microspore culture of Brassica vegetables could be improved by the optimization of cultivation system， genetic transformation and co-culture treatment.

Keywords： Brassica vegetables; isolated microspores; embryogenesis; plantlet regeneration; double haploid; breeding

0引言

十字花科蕓薹属蔬菜在中国栽培历史悠久，品种资源丰富，在蔬菜周年供应上占据重要地位。芸薹属蔬菜为异花授粉作物，杂种优势明显，而在优势杂交育种的过程中，获得一个纯合亲本至少需要5～6代的连续自交和选择，且在亲本纯化过程中需要严格的隔离措施，否则很容易造成混杂。采用单倍体育种的方法，经 1～2代即可获得纯合的育种材料，显著提高育种效率[1-2]，同时也能为基因工程[3-4]、细胞工程[5]等研究提供试验材料。单倍体育种的主要途径有花药或小孢子培养、未受精的胚珠培养、辐照处理花粉和种间或属间杂交诱导孤雌生殖[6]。通过游离小孢子培养获得的单倍体，可自发地或通过加倍剂进行二倍体化，得到完全纯合的双单倍体植株[7]，大大缩短材料纯化年限，是一种快速创造稳定育种材料的方法。

1982年Lichter[8]首次报道在甘蓝型油菜上通过游离小孢子培养的方法获得了再生植株，并发现小孢子胚胎形成的再生植株产量远高于花药培养。此后，游离小孢子培养技术在白菜[9]、结球甘蓝[10]、菜心[11]、青梗菜[12]、芥蓝[13]等多种芸薹属蔬菜及种间杂交种[14]上陆续获得成功，并应用于双倍体育种、突变育种、转基因育种、遗传分析和生理研究等领域[15-17]。吴江生等[18]育成的‘华双3号’是中国应用小孢子培养技术育成的第一个油菜品种。邓英等[19]通过小孢子培养技术选育出耐抽薹的叶用芥菜DH系，可用于补充春淡市场。

近年，游离小孢子培养技术已经取得了一定的进展，但这一过程的机理尚不明确[20]，诱导效率受到物种、基因型、供体条件、培养基、小孢子的发育阶段、培养方式和培养条件等多方面因素的影响，高效的培养体系尚未建立，该技术还未得到广泛的应用。

1影响小孢子培养的因素

1.1 植物材料

1.1.1 基因型供体植株的基因型是影响游离小孢子培养的重要因素，不同基因型的植株的产胚率[21]、生成再生植株的能力[22]和自然加倍率[23]不同。Zhang等[24]对29个基因型的羽衣甘蓝进行游离小孢子培养，6个基因型产生了胚状体，其中有4个基因型获得了再生植株。冯辉等[25]对15个品种的青梗菜小孢子进行诱导，发现产胚率最高的‘菜园’比最低的‘TAIKO’高116 倍。

1.1.2 生理状态花蕾的取材部位、采样时间、栽培地等都对小孢子的成胚能力有影响[26]，温室栽培的甘蓝出胚率高于大田栽培的甘蓝[27]，日照时间为11～12 h的芥蓝植株的胚状体诱导率是日照时间为5～6 h 的3～7 倍[28]。每天摘除将开放的花，使植株停留在蕾期阶段，从而使得小孢子发育同步化程度较高，有利于小孢子提高产胚率[29]。

1.1.3 发育时期通常情况下处于单核靠边期的小孢子出胚率最高，一般以花蕾长度或花瓣/花药的长度比值（P/A）来进行判断，现蕾后的生长天数[30]、花药颜色[19]也能作为判断标准。不同基因型[10]或不同生长状态[27]单核靠边期对应的花蕾长度不同，故用P/A进行判断更准确。李枸[31]对油菜品种‘危斯里欧’的观察发现，3.0～4.8 mm的花蕾小孢子大部分处于单核靠边期。王娜等[32]认为2.0～2.5 mm的芜菁花蕾含单核靠边期小孢子的比例最高。张恩慧等[30]对甘蓝的研究表明，花蕾长度在4.50～5.49 mm时，花粉细胞发育所处的单核靠边期的小孢子平均所占比例为76%。张振超[33]认为P/ A≈1可作为甘蓝、青花菜、羽衣甘蓝选择合适花蕾的标准。菜薹花蕾长2.5～3.5 mm，P/A为1/2～4/5时，大部分小孢子处于单核靠边期[34]，此时产胚率最高。

1.2 预处理

为提高胚状体的诱导率，需要对花蕾进行预处理。张小玲等[35]通过对花椰菜的花蕾进行磁场预处理，显著提高了花药培养愈伤组织诱导率。4℃低温胁迫处理24～48 h 可提高游离小孢子胚胎发生的能力，最佳处理时间和基因型密切相关[36-37]，低温预处理过程中加入适当浓度的乙烯合成抑制剂氨氧乙基乙烯基甘氨酸对孢子甘蓝小孢子胚的发生有积极影响[38]。但也有研究认为4℃处理抑制甘蓝型油菜小孢子胚胎的发生[39]。

1.3 培养基

1.3.1 基本培养基芸薹属蔬菜小孢子培养中常用的培养基是NLN培养基和B5培养基[40-41]，但也有学者认为1/2 NLN 培养基不仅能扩大出胚基因型的范围，还能提高胚状体的诱导率。王超楠对10个品种的小白菜进行小孢子培养，在NLN培养基中有7个品种获得了胚状体，而在1/2 NLN培养基中10个品种均获得了胚状体，且产胚率最高的品种‘菜园’的小孢子胚诱导率较使用NLN培养基提高了4.2倍[42]。

1.3.2 植物生长调节剂生长素和细胞分裂素等植物生长调节剂对诱导细胞生长和分裂有重要作用，芸薹属蔬菜小孢子培养中常用的生长调节剂是NAA 和6- BA[43-45]，另外，适当浓度的噻苯隆[46]可提高菜心小孢子的胚胎发生能力、存活率以及二倍体植株的比例。不同作物或同种作物不同基因型的材料对培养基中生长调节剂的有无、种类和水平的反应不同。芸苔素内酯可提高小白菜小孢子胚发生的频率和植株再生率，基因型为XM2的小白菜芸苔素内酯的最佳使用浓度为0.001 mg/L，而XM1和XM3的最佳使用浓度为0.002 mg/L[47]。王改改[48]认为0.5～1.5μmol/L 的褪黑素能显著提高甘蓝胚状体诱导效果，但不同材料对褪黑素浓度的要求不同。也有学者认为大多数小孢子胚胎的发生不需要外源激素诱导[7]，未添加生长调节剂的培养基中大白菜小孢子胚的诱导率高于添加6-BA、IBA和 NAA 的培养基[49]。

1.3.3 糖类糖类既充当碳源，也有调节渗透压的作用。不同作物对糖的种类和浓度的要求不同[50]，小白菜、青花菜、芜菁等芸薹属蔬菜一般添加13%的蔗糖作为碳源[16，51-52]，而添加13%的麦芽糖作为碳源完全抑制甘蓝型油菜胚状体的产生[53]。甘蓝添加蔗糖的最适浓度为14%[48，54]，在大白菜中添加10%的蔗糖的小孢子胚诱导率显著高于13%和16%[55]。用含17%蔗糖的NLN 培养基培养1 天后，换成含13%蔗糖的培养基能显著提高菜心和小菘菜小孢子胚的诱导率[56-57]，但会降低芸薹小孢子胚的诱导效率[58]。用含17%蔗糖的NLN 培养基培养甘蓝小孢子3天后转至含10%蔗糖的培养基可提高胚产量，较一直用含13%蔗糖的培养基的胚产量提高255.2%[59]。

1.3.4 其他添加物在培養基中添加活性炭可吸附在培养过程中产生的有毒物质，对胚状体的发生和成熟都有促进作用[60]，但活性炭也会吸附激素、营养物质的等有益成分[61]，戴希刚等[62]认为添加活性炭对小孢子胚的发生无促进作用，因此活性炭应酌情添加。抗坏血酸盐、胱谷甘肽等抗氧化剂[63]、组蛋白去乙酰化抑制剂[64]、等均可促进芸薹属蔬菜小孢子胚的发生和植株再生。曾爱松等[65]添加10 mg/L的阿拉伯半乳聚糖或阿拉伯半乳糖蛋白可促进胚状体的形成。非离子型表面活性剂对小孢子胚的发生也有促进作用，0.0001%的吐温20、曲拉通X-100和普朗尼克F-68均能显著增加紫菜苔小孢子胚发生的频率，吐温20可使植株再生率增加30%[66]。

1.4 培养密度

小孢子的培养密度也是影响胚胎诱导的重要培养条件，小孢子浓度过高和过低都不利于胚的发育。密度过高时，不仅会消耗大量的营养物质，还会使释放的有毒物质浓度升高;小孢子发育具有群体效应，过低的密度同样会影响小孢子胚的发生。大白菜[67]、芥菜[68]、青花菜[69]、菜心[70]等芸薹属蔬菜的小孢子培养密度一般在1×105～2×105个/mL 为宜。但不同种或同一品种不同基因型植株对相同的培养密度有不同反应。基因型为 KTCBH-2085、KTCBH-6621和 KTCBH-6045的甘蓝最适培养密度为4×106个/mL，而‘Golden Acre’的最适培养密度为6×106个/mL[10]。

1.5 高温热激

高温热激是小孢子的分化启动所必须的[71]，可有效提高小孢子对称分裂比例，增加胚状体的形成[72]。同一物种不同基因型对相同的处理温度、时间和培养密度有不同的反应[10]。芸薹属蔬菜一般采用（32.5± 0.5）℃热激处理24 h 来提高小孢子的成胚能力[61]，而（32±0.5）℃处理48 h对青花菜[16]、大白菜[55]的成胚诱导效果更好。Wang等[73]认为32℃处理18 h有利于紫菜薹小孢子存活，维持细胞分裂并进一步诱导胚状体形成。

1.6 胚状体发生及植株再生

少数游离小孢子在经胁迫诱导后发生重编程，从配子体发育途径转变为胚胎发生途徑，细胞死亡率高和重编程效率低是限制小孢子成胚的重要因素[7]。游离小孢子在高温培养24 h后，可见部分小孢子直径增大，此时小孢子膨大的数量及比例是快速评估最终产胚率的参考指标[74]。3～4天后小孢子开始第一次分裂，8～9天可见细胞团，11～13天原胚出现，进而发育成球形胚、心形胚、鱼雷形胚子叶形胚或畸形胚。然后将胚移至MS 或B5培养基，给予光照，诱导植株再生。其中子叶型胚的植株再生频率最高[75]，通过摇床震荡培养可促进子叶形胚形成，提高胚胎发育的同步性[76]。此外，胚的再生频率还与基因型有关[36]。B5固体培养基中添加1%琼脂、3.0 mg/L或5.0 mg/L硝酸银，并在4℃下处理2天或5天可显著提高植株的再生率[77]。

2植株的倍性鉴定与加倍

通过游离小孢子培养获得的再生植株是单倍体、二倍体、多倍体和非整倍体构成的混合群体[78]。植株倍性鉴定的方法主要有：形态学法[79]、花粉粒形态分辨法[80]、根尖或侧枝生长点染色体计数法[81]、气孔保卫细胞叶绿体计数法[82]、气孔长直径测量法[81]、DNA流式细胞仪法[83]等。

2.1 自然加倍

自然加倍可能来源于未减数分裂的配子，或最初几次原胚的核内有丝分裂，具有不会出现核畸变的优点[84]。不同植株或不同培养条件所产生的再生植株自然加倍率不同，羽衣甘蓝的植株的自然加倍率为23.33%～37.50%[85]，青花菜的自然加倍率为 30%～ 35%[16]。

2.2 人工加倍

通过加倍剂处理小孢子细胞或再生植株幼苗可实现人工加倍[86]，秋水仙素是一种常用的染色体加倍剂，但也具有较大的毒性[87]，使用浓度越高、处理时间越长，植株死亡率越高[33]。因此需要权衡好浓度、处理时间和加倍效率之间的关系。用70 mg/L的秋水仙素处理羽衣甘蓝幼苗 9～11天，加倍率达 54.55%[85];用200 mg/L秋水仙碱处理甘蓝、青花菜和羽衣甘蓝的再生植株幼苗20 h，获得的效果最好[33]。但人工加倍产生嵌合株的比例高于自然加倍，用1%秋水仙素处理青花菜幼苗的嵌合株发生率为8%，高于自然加倍的5%[88]。 3展望

近年来，研究者们对小孢子胚胎发生的动态过程、细胞学分析和分子基础的认识都有所提高，技术也越来越成熟[89-90]。但基因型仍是影响游离小孢子培养技术应用的主要难题，不同种或者是同种不同基因型植株在同一培养条件下的产胚率存在差异，高效、通用的小孢子培养体系尚未建立。培养基成分、培养温度、培养密度等也都是影响小孢子培养的重要因素，且同一影响因素在不同的研究中作用效果不一。例如，一般认为培养基中添加植物生长调节剂对小孢子胚的发生有促进作用，而有的学者认为小孢子胚的产生无需外源激素。这些影响因素的作用机制尚未研究透彻，不利于小孢子培养体系的优化。

进一步研究各因素对小孢子胚胎发生、植株再生和再生植株加倍的影响，深入探讨小孢子发育的调控机理，对于芸薹属蔬菜的基础研究和育种实践尤为重要。为提高小孢子胚胎发生的频率，可以从以下方面进行尝试。

（1）探讨花蕾形态与小孢子发育时期的关系，明确最佳取材时间;从预处理方式、培养基成分、热激处理、培养条件等方面继续优化芸薹属蔬菜游离小孢子培养的体系，探索不同品种通用的高效培养体系。

（2）由于材料的基因型与出胚率密切相关，现已发现胚状体发生能力具有加性效应，高胚发生能力由显性核基因控制，因此先鉴定到影响胚状体发生能力的关键基因，然后通过杂交或遗传转化等方式，将易成胚的基因转化到难成胚的品种上，从而提高芸薹属蔬菜游离小孢子培养的产胚率和植株再生率。

（3）张振超等[91]将甘蓝类植物小孢子与青花菜小孢子共培养，提高了青花菜小孢子胚胎发生率、胚胎质量及植株再生率。因此，将易成胚的材料与难成胚的材料共培养也是一个可以尝试的新思路。

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