硫氧还蛋白还原酶1（TrxR1）属于吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶家族，作为目前已知的唯一能够还原硫氧还蛋白（Trx）的酶，TrxR1可以将氧化型的Trx还原成还原型Trx。还原型的Trx能够还原多种蛋白的二硫键，进而调控细胞的多种生物进程，如细胞增殖、分化以及凋亡等等。

桁架平台提升过程需分段进行，每提升10～15m进行一次检查，须确保桁架平台及电动施工升降平台无异常状况后方可继续提升。

肿瘤细胞的代谢水平远高于正常细胞，因而在细胞内会产生大量活性氧。因此，肿瘤细胞往往会通过诱导抗氧化酶的表达来维持自身的氧化还原稳态，而TrxR1是其中一种被诱导的抗氧化酶。近年来研究发现，TrxR1在多种肿瘤组织和细胞中高表达，如乳腺癌、胃癌、肺癌和肠癌等，并通过蛋白激酶B（PKB,又名AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及信号传导及转录激活蛋白3（Stat3）等信号通路促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡及诱导耐药，是一个理想的抗肿瘤药物开发靶点。目前靶向TrxR1的药物具有丰富的骨架结构，但尚无进入临床使用的TrxR1靶向药物，其中一大制约因素就是缺乏在药物筛选早期可以快速准确评价药物特异性的细胞模型。

我们在前期研究中发现，通过小干扰RNA（siRNA）降低肿瘤细胞中TrxR1的表达水平，可以协同增强TrxR1抑制剂的抗肿瘤及TrxR1酶抑制活性。该协同作用可以有效区分特异性TrxR1抑制剂和非特异性TrxR1抑制剂，但是短期干扰基因表达存在干扰时间短，影响因素多等缺点，很难用于快速高通量特异性TrxR1抑制剂筛选。而构建具有酶活力的TrxR1过表达细胞可以克服上述短期干扰基因表达的缺点，可能是一种理想的TrxR1药物筛选的细胞模型。

而基于人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）型病毒构建的慢病毒载体可以高效感染处于分裂期和非分裂期的细胞，能够携带大片段基因，且不易诱发宿主免疫反应，更重要的是能将目的基因高效整合到宿主细胞染色体中，不易引起插入突变，理论上能够在细胞内永久表达并在子代中稳定表达目的基因，而且改造后的慢病毒的假病毒没有复制能力，具有较好的生物安全性，有广泛的细胞感染谱，因此是一种理想的基因转移载体。HEK293细胞是一种细胞转染常用工具细胞，具有转染效率高，易于培养等特点。而我们在前期实验中也发现HEK293细胞相较于其他肿瘤细胞以及工具细胞TrxR1表达最低，适用于构建TrxR1过表达细胞株。

2.2.2 Western blotting检测TrxR1的蛋白表达情况 通过Western blot，我们发现HEK293和HEK293-NC两株细胞中的TrxR1 蛋白表达量近乎一致，且显著低于HEK293-TrxR1-OE细胞株的TrxR1蛋白表达量，分别为其0.02和0.05倍（图2B、C）。

1 材料和方法

1.1 材料

采用经典的分子克隆方法，将基因片段连接到慢病毒载体上，并转化入大肠杆菌Stbl3，挑选阳性克隆菌落进行初步的双酶切鉴定之后，进行DNA测序，获得插入了目的基因的重组慢病毒表达载体：pLVXPuro-TXNRD1载体。序列图谱如图1所示。

1.1.2 试剂 二甲基亚砜（DMSO）、甘氨酸、过硫酸铵（APS）、丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠（SDS）、N，N，N，N'-四甲基乙二胺（TEMED）、Tris、NADPH、胰岛素、乙二胺四乙酸（EDTA）、大鼠肝脏硫氧还蛋白还原酶和重组人硫氧还蛋白（Sigma-Aldrich）。Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖检测试剂盒（Dojindo）。兔单克隆抗人TrxR1抗体（Abcam）。Trizol、DMEM培养基、PBS、0.25%胰酶-EDTA消化液、青霉素-链霉素双抗、胎牛血清（FBS）、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物和BCA 蛋白测定试剂盒、蛋白分子量marker试剂（Thermo Fisher Scientific），蛋白上样缓冲液和RIPA裂解缓冲液（碧云天）。PVDF膜（Millpore）。RNA反转录试剂盒、TB-green定量PCR试剂盒（Takara），细胞培养板（Corning）。

1.2.5 重组细胞株细胞内TrxR1酶活力测定 蛋白质过表达不一定引起酶活力上升，为了验证我们构建的HEK293-TrxR1-OE细胞株TrxR1是否有活力，分别将HEK293、HEK293-NC 以及HEK293-TrxR1-OE 细胞25万/孔铺于六孔板，37 ℃、5% CO培养箱培养24 h。将细胞消化收集、裂解、提取蛋白，BCA定量。将提取的蛋白采用终点胰岛素法来测定细胞内TrxR1酶活力。20 μg蛋白和50 μL含有0.3 mol/L胰岛素，660 μmol/L NADPH，3 mol/L EDTA以及1.3 μmol/L重组人Trx蛋白的pH为7.6的100 mol/L Tris缓冲液在37 ℃孵育1 h。加入200 μL pH为8.0的含有1 mol/L DTNB的6 mol/L盐酸胍溶液终止孵育。使用BioTek Cytation5酶标仪检测，设置为化学显色模式，设置波长为412 nm。相同条件下，使用梯度稀释的大鼠肝脏TrxR1蛋白（218.57 U/mg，Sigma）绘制标准曲线，计算各细胞中TrxR1的酶活力。

1.2 方法

以故宫的五彩蝴蝶瓶为例，除去其排版上的失误，译文并没有传达出文物解说词的文化内涵，而是大篇幅描述了五彩蝴蝶纹瓶的外观等自然属性。中国古代瓷器装饰题材极为丰富，大多“图必有意，意必吉祥。”“蝶”与“耋”谐音，“耋”意为七八十岁的年纪，泛指老年，以“百蝶”寓长寿之意。而对相同题材的蝴蝶瓶描述，大都会博物馆则用精炼的一句话描述了其文化含义，象征意义：The Chinese term for butterfly (hudie) is also a rebus for the accumulation of blessings.(Vase with Butterflies)

1.2.2 细胞转染及细胞系筛选 将空载慢病毒pLVXPuro和重组慢病毒pLVX-Puro-TXNRD1病毒液冰浴融解，与完全培养基1∶1混合，加入终浓度为3 μg/mL的聚凝胺（Polybrene），轻柔混匀，覆盖HEK293细胞，放置于37 ℃、5%CO环境中培养过夜。次日，移除含病毒的培养基，加入新鲜的培养基，37 ℃、5%CO环境中培养，并使用含嘌呤霉素（Puro）以及10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培养基进行筛选纯化，将用pLVXPuro-TXNRD1 病毒液转染后的实验组细胞命名为HEK293-TrxR1-OE，pLVX-Puro病毒液转染后的对照组细胞命名为HEK293-NC。

选取原发性高血压患者100例,时间为2016年2月-2017年1月,根据其治疗方案的差异分组,50例为一组。

1.2.1 目的基因片段的制备与慢病毒载体构建 利用PCR技术扩增基因（基因名：，mRNA序列号：NM_182729.3）片段，然后将PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收。取目的基因的凝胶回收产物与慢病毒载体pLVX-Puro用限制性内切酶XhoI/EcoRI进行双酶切，并将酶切产物回收，分别进行连接反应，得到基因的重组慢病毒连接产物。用感受态细胞对连接产物进行转化，将转化液涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃培养过夜；次日，从各平板上挑取单菌落，进行质粒DNA的提取与双酶切凝胶电泳鉴定。挑选阳性克隆菌落对应的菌液培养过夜，将质粒抽提后进行DNA测序鉴定（由通用生物（安徽）股份有限公司通过Sanger 双脱氧测序法完成）。获得pLVX-Puro-TXNRD1重组慢病毒。

1.2.3 RT-qPCR 收集适量重组HEK293细胞，加入适量裂解液（Trizol）裂解后，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清液；再加入异丙醇，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取RNA沉淀。以75%乙醇清洗2次，检测RNA浓度。RT-qPCR实验采用Takara试剂，反转录的条件按照试剂说明书操作，首先根据样品浓度取RNA 1 μg，42 ℃置于PCR 仪上2 min，去除全基因组DNA干扰。然后进行反转录，将10 μL的步骤1的反应液和试剂盒内的试剂混合后37 ℃置于PCR仪上15 min，随后于85 ℃保持5 s终止反应，最后将反转录产物于-20 ℃保存备用。通过TB Green 试剂盒采用2法进行RT-qPCR 检测TrxR1 在HEK293、HEK293-NC、HEK293-TrxR1-OE细胞株中的表达量。内参基因为GAPDH。引物序列如下：TrxR1-F：AGCTCAGTCCACCAATAGTGA，TrxR1-R：GGTATTTTTCCAGTCTTTTCAT；GAPDH-F：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，GAPDH-R：AGGG GCCATCCACAGTCTTC。

李彬[65]针对地方国有粮食企业，指出内部控制的主要内容。在公司层面，要设计合理的内部控制组织架构，建立健全决策机制；在业务层面，需要在收入支出、粮食采购储备、资产管理、合同管理、仓储管理和安全生产方面建立健全内部控制。宋芳[66]提出完善内部控制除了要关注管理机构、内部机构，还需要建立有效的激励机制，注重企业文化、提高企业内部会计控制管理。刘玉静[67]提出强化国有粮食企业内部控制需要单位负责人率先垂范，加强对内部人员的监督和内部审计，建立有效的会计系统，强化外部监督。

1.2.4 Western blot检测重组细胞株TrxR1蛋白的表达细胞消化计数，接种小皿中，培养24 h后观察细胞贴壁状态及融合度，待细胞长满后蛋白提取。收集细胞，离心，弃上清，加裂解液适量，冰上裂解，裂解完全后12 000 r/min离心10 min。BCA定量。使用4%～20%的梯度SDS-PAGE电泳分离30 μg总蛋白，将蛋白300 mA恒流转移至PVDF 膜，5%（）BSA（溶解于含有0.1%Tween-20的TBS溶液中，TBST）室温封闭2 h，去离子水清洗膜后加入抗人TrxR1抗体后4 ℃孵育过夜。次日，将膜清洗3遍，5 min/次，分别加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和兔抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，将膜再次清洗3 遍，5 min/次，使用显影液孵育，在Chemical Doc Touch凝胶成像系统中成像拍照。使用ImageJ软件对照片灰度值进行定量。

新的改革，往往缺乏实际操作和有效的执行能力。从实际操作层面来看，政府会计制度已经公布，未来事业单位会计将更加复杂。会计的两套报告，一套满足财务管理需求，另一套则满足事业单位的管理需求。在常规会计制度的框架内，财务人员的专业判断力不断提高。

1.2.6 重组细胞株细胞内TrxR1酶活力的成像分析 通过特异性TrxR1酶活力荧光探针TRFS-green分别检测HEK293，HEK293-NC和HEK293-TrxR1-OE活细胞中的TrxR1酶活力。分别将HEK293、HEK293-NC以及HEK293-TrxR1-OE细胞25万/孔铺于六孔板中，37 ℃、5%CO培养箱培养24 h加入10 μmol/L TRFS-green探针，培养4 h。使用EVOS FL荧光显微镜拍照，通过平行试验使用Novocyte流式细胞仪定量荧光强度。

1.2.7 重组细胞株的功能检测 为了研究HEK293-TrxR1-OE细胞是否适用于靶向TrxR1抗肿瘤药物的筛选，按照上述TrxR1酶活检测方法，检测TrxR1特异性抑制剂auranofin对HEK293，HEK293-NC和HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1酶活力的抑制活性。细胞过夜培养后，加入含有auranofin的培养基，培养24 h。对照孔为与auranofin等体积的DMSO。数据按照对照孔数值归一化处理。

进一步采用CCK8 实验分别检测auranofin 对HEK293，HEK293-NC和HEK293-TrxR1-OE细胞的增殖抑制作用。96孔细胞培养板中每孔接种2000个细胞，培养12 h。实验组加入指定浓度的auranofin。对照组给予相同体积的DMSO。空白组为不含细胞的细胞培养基。药物刺激24 h后，每孔加入10 μL CCK8试剂，37 ℃孵育2 h。使用酶标仪于450 nm测量吸光值用以计算细胞增殖力：细胞增殖抑制率=（-）/（-）×100%。

1.3 统计学处理

统计学分析采用SPSS 18.0 软件，数据皆采用均数±标准差表示，采用单因素方差分析法进行多组间比较。＜0.05为差异有统计学意义，实验独立重复3次。

2 结果

2.1 载体构建的鉴定

1.1.1 仪器 CO培养箱和酶标仪（Thermo Fisher），荧光倒置显微镜（Olympus），小型垂直电泳仪和多功能凝胶成像系统（Bio-Rad），Novocyte流式细胞仪（安捷伦）。

2.2 HEK293-TrxR1-OE稳转细胞株系的鉴定

在相同浓度的TRFS-green探针作用相同时间后，HEK293-TrxR1-OE 细胞中的绿色荧光显著强于HEK293 和HEK293-NC 细胞（荧光强度HEK293：19 800.33±777.70 AU；HEK293-NC：20 089.00±694.20 AU；HEK293-TrXR1-OE：43307.33±810.6AU，＜0.005，图3）。

因此，本研究运用慢病毒载体构建稳定过表达含硒蛋白TrxR1的HEK293细胞株，系首次在体外成功构建无需添加硒元素培养的硒蛋白过表达细胞株，为含硒蛋白生物学功能的研究提供了借鉴。并且通过RT-qPCR、Western blot、胰岛素终点法以及TRFS-green探针成像证实过表达的内源性TrxR1具有酶活力，而该细胞模型进一步验证了我们的前期研究发现，利用该细胞模型以及对照HEK293 细胞将可快速准确筛选特异性TrxR1靶向药物，为TrxR1 靶向药物研究提供有效的筛选模型。

2.2.3 HEK293-TrxR1-OE细胞株细胞内TrxR1酶活力测定 通过胰岛素终点法，我们对HEK293、HEK293-NC以及HEK293-TrxR1-OE细胞中的TrxR1酶活力进行了测定（表1）。HEK293 和HEK293-NC 细胞中TrxR1的酶活分别为0.25±0.04和0.32±0.04 U/mg，而HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1的酶活力则为1.14±0.17 U/mg，远高于HEK293和HEK293-NC细胞。

2.2.1 RT-qPCR检测TrxR1的mRNA表达情况 提取细胞株中的总RNA 进行RT-qPCR 分析，我们发现HEK293-TrxR1-OE细胞株中TrxR1的mRNA表达量显著高于HEK293和HEK293-NC两株细胞，分别约为HEK293 和HEK293-NC 细胞的2.32 和3.36 倍（＜0.005，图2A）。

2.2.4 重组细胞株的增殖毒性能力检测和细胞内TrxR1酶活测定 TrxR1 酶活力的抑制效率结果显示auranofin 对于过表达具有酶活力TrxR1 的HEK293-TrxR1-OE 细胞中的TrxR1 酶活力的抑制效率（IC：5.14±0.33 μmol/L）相较于HEK293 以及HEK293-NC细胞显著下降（IC分别为1.21±0.07 μmol/L 和1.20±0.05 μmol/L，图4A）。上述3株细胞的增殖抑制结果显示auranofin对HEK293-TrxR1-OE细胞的增殖抑制作用（IC：2.78±0.35 μmol/L）相较于HEK293以及HEK293-NC 细胞显著下降（IC分别为0.30±0.05 μmol/L 和0.25±0.03 μmol/L，图4B）。

结合当前已有研究成果和笔者实地调查，三峡库区农业面源污染主要来源自农业生产和农村生活，主要包括农田种植、畜牧养殖和居民点生活污染，具体有化肥、农药等农用化学品的使用，农田地表径流，农作物秸秆和旱坡地水土流失，畜禽养殖废物、农村生活污水以及农村生活垃圾等固体废物污染，具体发生过程如图1所示。

3 讨论

本研究通过经典方法构建TrxR1蛋白过表达的慢病毒载体，选取HEK293作为转染对象，并通过筛选出的最佳的嘌呤霉素浓度对转染细胞进行筛选，最后获得稳定过表达TrxR1的细胞株。通过RT-qPCR实验，我们发现HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1的mRNA表达水平相较于正常HEK293以及对照HEK293-NC细胞可以分别上升2.32和3.36倍。不仅如此，我们通过Western blot实验发现该细胞中TrxR1的蛋白表达水平相较于正常HEK293以及对照HEK293-NC细胞也显著上升，证明通过所构建的TrxR1过表达慢病毒载体可以在HEK293细胞中显著增加TrxR1的mRNA和蛋白表达。而通过胰岛素终点法去检测内源性TrxR1酶活力，我们发现证明该细胞中的TrxR1酶活力也同样显著上升，分别达到了正常HEK293和对照HEK293-NC细胞的4.56 倍和3.56 倍。不仅如此，我们利用TRFSgreen探针成像，也发现HEK293-TrxR1-OE细胞内的平均荧光强度显著提高，分别达到了正常HEK293和对照HEK293-NC细胞的2.19倍和2.15倍。TRFS-green探针是第一代TrxR1特异性小分子荧光探针，该探针的作用原理是会经由TrxR1剪切其分子结构中的二硫键而暴露所含荧光基团萘二甲酰亚胺发出绿色荧光，并且该探针对细胞内主要含硫醇物质GSH和蛋白质的半胱氨酸残基以及内源性还原剂维生素C和NADPH无反应，因而可以特异性检测细胞内TrxR1的酶活力，而TRFS-green探针成像的结果也进一步说明HEK293-TrxR1-OE 细胞中的TrxR1 具有较高的酶活力。因此，利用慢病毒载体构建的HEK293-TrxR1-OE细胞可以稳定过表达具有酶活力的TrxR1，相较于国外之前类似的报道，需要在培养基中加入硒盐才可以刺激细胞产生具有酶活力的TrxR1，简化了细胞的培养条件，更利于后续实验的稳定开展。

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HEK293-TrxR1-OE细胞的构建也扩展了在体外进一步研究类似TrxR1的含硒蛋白功能的的可能性。比如彭波等人通过构建过表达含硒蛋白SelK的肿瘤细胞株，发现SelK能促进胞浆中游离钙离子浓度的升高，进而引起肿瘤细胞发生凋亡，同时降低细胞与基质之间的黏附力和细胞的迁移能力，初步阐明SelK的生物学功能，也为肿瘤的治疗提供了新的潜在靶点。以及刘侃等人通过构建携带SEPP1 基因的重组慢病毒载体，并使用其感染ccRCC 细胞株，进一步研究SEPP1 基因的过表达在肾癌细胞增殖中发挥的作用，发现SEPP1过表达细胞增殖能力明显降低、克隆形成能力明显降低，SEPP1过表达引起肾癌细胞G2/M期阻滞，探讨了SEPP1与肿瘤发生、增殖的关系，为研究SEPP1 与肿瘤转移和预后的关系奠定了基础。以上研究也证明虽然含硒蛋白的翻译机制仍待探索，但是越来越多类似HEK293-TrxR1-OE细胞的构建将为研究含硒蛋白的代谢，合成以及生物学功能提供物质基础。

而基于前期研究结果，降低肿瘤细胞内TrxR1表达量与特异性TrxR1抑制剂活性存在协同作用，为了初步研究HEK293-TrxR1-OE细胞是否适用于靶向TrxR1抗肿瘤药物的筛选，我们进一步通过TrxR1特异性抑制剂auranofin 在正常HEK293、对照细胞HEK293-NC以及HEK293-TrxR1-OE细胞中对TrxR1酶活力的抑制效率以及抗增殖作用进行了分析，发现auranofin对HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1酶活力的抑制效率以及抗增殖作用相较于HEK293 以及HEK293-NC细胞均显著下降，说明auranofin通过抑制TrxR1活性抑制细胞的增殖，而过表达具有酶活力的TrxR1会导致TrxR1抑制剂对其抑制效率下降，因此利用TrxR1过表达及其对照细胞作为细胞模型，可以通过TrxR1酶活及细胞增殖检测快速准确确定靶向TrxR1药物的特异性，这将大大缩短靶向TrxR1药物的早期筛选流程。而联合TrxR1基因敲除细胞等细胞模型也将进一步提升药物筛选的准确性。比如罗昕等通过CRISPR-Cas9技术构建SF3B1突变等位基因敲除的Mel202 SF3B1 mut-KO 单克隆细胞株用于携带SF3B1 突变的葡萄膜黑色素瘤的药物筛选，经过对Targetmol公司的已知活性化合物库（L1000）和上市药物库（L4000）约5000个化合物进行筛选后，发现13个化合物对SF3B1突变的Mel202细胞具有良好的选择性抑制活性，而后期研究进一步发现这13个化合物中的tetrandrine和lapatinib是良好的靶向SF3B1突变的先导化合物。而Huang等曾报道利用p53-EGFP报告基因系统，在DLD1直肠癌细胞中筛选恢复p53通路的小分子化疗药物。Wang等构建稳定表达PGL3-luc的直肠癌SW480细胞，用于恢复p53转录活性化合物的筛选。胡琳珊等选择人直肠癌细胞HCT116和骨肉瘤细胞U2-OS，构建HCT16-p53BS-Luc/Renilla和U2-OS-p53BS-mCherry两种细胞模型，同时证明了已知的p53靶向小分子CDDP，Dox和Nutlin-3在这两种模型中均可激活p53信号通路。以上研究证明构建基因编辑细胞株作为药物筛选模型可以快速准确获得先导化合物，缩短新药研发的周期。

综上所述，本研究通过慢病毒载体成功建立TrxR1 稳定过表达HEK293细胞，而该细胞稳定过表达的TrxR1蛋白同样具有高酶活力，可作为细胞模型快速准确筛选特异性TrxR1 靶向药物和基因功能，推进TrxR1靶向药物的研发，用于筛选各种靶向TrxR1的药物，为相关药物的研发提供参考。