叶面施锌对油菜镉锌生物可给性与形态的影响

2022-05-05陶雪莹徐应明王林刘畅孙约兵梁学峰

农业环境科学学报 2022年4期

陶雪莹，徐应明，王林*，刘畅，孙约兵，梁学峰

（1.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191；2.农业农村部产地环境污染防控重点实验室，天津 300191）

镉（Cd）是一种有毒有害的重金属元素，主要通过食物链进入人体，严重威胁人体健康。对于非吸烟人群，食物是人体Cd摄入的主要来源。有研究表明，来自蔬菜的Cd摄入最高可占人体总摄入量的83%。过量摄入Cd会对肾脏、骨骼、肝脏以及肺等器官产生毒害；更严重的是，Cd 是一类致癌物，对人体具有极强的致癌作用。因此，采取有效措施减少蔬菜Cd含量，降低其健康风险迫在眉睫。

锌（Zn）与Cd 具有相似的化学性质，添加外源Zn可通过Zn/Cd 拮抗作用显著抑制植物对Cd 的吸收和转运。大量研究表明，在Cd 污染土壤中，喷施Zn肥可有效降低生菜、辣椒、黄瓜以及油菜等多种蔬菜可食部位的Cd 含量。另外，Zn 是人体生长发育必需的微量元素，由于土壤和作物Zn 含量偏低，全世界有1/3 人口遭受缺Zn 危害，而施用Zn 肥是提高作物Zn 含量和强化人体Zn 营养的重要措施。因此在Cd 污染农田喷施Zn 肥可以为人体健康提供双重效益。

在经口摄入的食物中，只有部分营养和有害元素能够被人体消化吸收。因此相对于总量，元素在胃肠道中消化溶出的比例或含量，即生物可给性，能更准确地表征人体对其吸收利用的潜力以及由此引发的健康风险。近年的研究表明，喷施Zn 肥不仅可以影响作物Cd 和Zn 的含量，还会影响其生物可给性。例如，陶雪莹等研究发现，在河南Cd 污染麦田中，喷施12 mmol·LZnSO溶液显著降低小麦籽粒Cd 在胃相的生物可给性比例，显著提高Zn的可给性比例。TANG 等研究表明，在浙江Cd 污染菜地上，喷施以ZnSO为基体的复合Zn 肥可显著降低空心菜的生物可给态Cd 含量，显著提高其可给态Zn 含量。然而迄今为止，有关Zn肥调控作物Cd和Zn生物可给性的作用机制并不明确。

土壤重金属的化学形态是影响其生物可给性的关键因素。TANG 等研究发现，在5 种人工制备Cd污染土壤老化过程中，土壤Cd 的可给性比例与水提取态、可交换态Cd的占比有显著正相关性，这表明土壤可给态Cd 主要来源于这两个形态。KARADAŞ等对土耳其重金属复合污染土壤进行研究，发现可还原态Cd对土壤可给态Cd的贡献最大，酸提取态Zn对土壤可给态Zn 的贡献最大。近年来，人们采用与土壤类似的连续提取法研究了植物体内重金属的化学形态，发现Cd 和Zn 的化学形态与其毒性及迁移能力密切相关。然而，植物体内Cd 和Zn 的化学形态是否像土壤一样，与其生物可给性有密切关系，这一问题目前尚不明确。揭示这两类指标之间的关系将有助于阐明作物体内Cd 和Zn 的消化溶出机制以及生物可给性的变化机制。

近期本团队通过水培实验发现，喷施Zn 肥显著影响了叶用油菜（L.）地上部Cd 和Zn 的生物可给性比例；推断Zn 肥可能通过影响油菜Cd 和Zn 的化学形态，进而调控其生物可给性。然而，该研究并没有直接证据可以支持这一假设。鉴于此，本文通过土壤盆栽试验，采用体外消化方法和连续提取法，研究喷施不同形态和浓度的Zn 肥对两种叶用油菜Cd 和Zn 的含量、生物可给性以及化学形态的影响，并通过相关性分析和线性拟合方法研究Cd和Zn 的生物可给性与化学形态的关系，探讨喷施Zn肥调控油菜Cd 和Zn 生物可给性的作用机制。本研究成果可以为喷施Zn 肥降低油菜Cd 污染健康风险提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤取自湖南省湘潭市某Cd 污染农田，土壤类型为第四纪红土发育的潴育型水稻土，基本理化性质：pH 值为 5.57，总 Cd 和总 Zn 含量分别为 1.94 mg·kg和245.46 mg·kg，有机质含量为 3.89 g·kg，阳离子交换量为11.86 cmol·kg，碱解氮、速效磷和速效钾含量分别为 92.43、21.52 mg·kg和 117.35 mg·kg。

供试叶用油菜为Cd低积累品种华骏和普通品种寒绿，种子由天津市农科院提供。喷施的Zn 肥为硫酸锌（ZnSO·7HO）和乙二胺四乙酸锌二钠（EDTA·NaZn·4HO，EDTA-Zn）；前者为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；后者纯度高于98%，购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 试验设计

盆栽试验采用双因素完全组合设计。第一个因素为油菜品种，种植2 种油菜。第二个因素为不同喷施处理。根据团队前期研究发现，喷施ZnSO和EDTA-Zn 可有效降低油菜Cd 含量，但预实验发现喷施高浓度EDTA-Zn 溶液对油菜叶片有一定的伤害，需要降低施用浓度。因此本试验中ZnSO喷施浓度为4 mmol·L和12 mmol·L（以Zn 计，下同），分别记为 S1 和 S2；EDTA-Zn 喷施浓度为 1.33 mmol·L和4 mmol·L，分别记为E1和E2；另外设置对照处理，喷施去离子水，记为CK。本试验共设置10个处理，每个处理重复3次。

盆栽试验于2020 年5—7 月在玻璃温室内进行，室内温度为20~35 ℃，自然光照，盆栽器皿按照随机区组排列。供试土壤风干过5 mm 筛后装盆，每盆装土 2 kg，同时施入 0.64 g CO（NH）和 0.51 g KHPO（分析纯）作为底肥。拌土后每盆加入800 mL 去离子水，稳定7 d，然后播种。待幼苗长至4 片真叶时每盆间苗至5 株。在油菜种植过程中不定期浇灌去离子水，使土壤含水量维持在田间持水量的70%左右。在油菜播种后的第49、55 d 和61 d，用微型喷雾瓶喷施Zn 肥，每盆每次喷施9 mL 溶液，并用铝箔遮盖盆中土壤，以防溶液进入土壤。在油菜播种后第70 d收获全部植株。

1.3 样品处理与分析

1.3.1 样品处理以及Cd和Zn含量测定

收获的油菜地上部样品先用自来水冲洗去除灰尘；然后在2%HNO溶液中浸泡2 min，以去除表面残留的Zn 盐；再用去离子水冲洗干净，吸干表面水分，保存在4 ℃冰箱备用。在分析样品当天，用陶瓷刀具将每盆油菜地上部切碎混匀，用于重金属含量、可给性及化学形态的分析。

称取4 g 鲜样，在烘箱中70 ℃烘干至恒质量，然后加入8 mL 电子级（BV-Ⅲ）浓HNO，在电热消解仪（ED54，北京莱伯泰科）上进行消解；使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，ICAPQc，Thermo Fisher Scientific，德国）测定消解后样品溶液中的Cd和Zn含量。同时采用美国国家标准与技术研究院提供的菠菜叶标样SRM1570a 对消解和测定过程进行质量监控；结果显示，标样中Cd 和Zn 的回收率均在95%~105%范围内。

1.3.2 体外消化试验

根据RUBY等和FU等的方法进行改进，采用PBET（Physiologically based extraction test）法测定油菜地上部Cd 和Zn 的生物可给性。在胃消化阶段，称取3 g 鲜样，用研钵研磨，然后加入30 mL 模拟胃液（含柠檬酸 0.50 g·L、苹果酸 0.50 g·L、乳酸 0.42 mL·L、醋酸 0.50 mL·L、胃蛋白酶 1.25 g·L，用浓盐酸调pH 值至1.50），在37 ℃下旋转振荡1 h。在小肠消化阶段，用NaHCO粉末将消化液pH 值调整至7.0，加入 1 mL 胆盐溶液（52.5 g·L，以 0.1 mol·LNaHCO溶液配制）和15 mg胰酶，在37 ℃下旋转振荡4 h，离心分离上清液并准确记录其体积。在小肠消化阶段分离的上清液经0.45µm 滤膜过滤并稀释后，采用ICP-MS测定其Cd和Zn含量。

1.3.3 化学形态提取测定

采用连续提取法分析油菜地上部Cd 和Zn 的化学形态。称取5 g 鲜样，加入25 mL 提取液，研磨匀浆后在25 ℃下恒温振荡提取12 h，再以4 000 r·min离心10 min 并回收上清液；在残渣中加入25 mL 相同提取液继续振荡提取12 h，离心并回收上清液，合并两次上清液得到该组分溶液。提取液依次为：80%乙醇、超纯水、1 mol·LNaCl、2%醋酸（HAc）以及 0.6 mol·LHCl，提取后分别得到乙醇提取态（F）、HO提取态（F）、NaCl 提取态（F）、HAc 提取态（F）以及HCl 提取态（F）。将各组分溶液转移至消解管中，80 ℃下蒸干后加入浓HNO消解，使用ICP-MS 测定其Cd和Zn含量。

1.4 数据计算与分析

参考王林等和SUN 等研究，根据消化液体积与元素含量以及油菜样品质量与元素含量，计算油菜Cd和Zn的生物可给态含量以及生物可给性比例：

式中：为油菜中 Cd、Zn 的生物可给态含量，µg·g；C为测定的小肠消化液中可溶态Cd、Zn 的质量浓度，µg·mL；V为小肠消化液的体积，mL；为体外消化实验中加入油菜的质量，g。

式中：为油菜中Cd、Zn 的生物可给性比例，%；C为油菜样品Cd、Zn总质量分数，µg·g。

试验数据采用Excel 2016 和SPSS 24 软件进行统计分析。采用单因素方差分析以及最小显著性差异（LSD）法分析不同处理间的差异显著性；采用Pearson相关系数法以及线性拟合法研究Cd 和Zn 生物可给性与化学形态之间的相关性与线性关系。采用Ori⁃gin 2019软件制图。

2 结果与分析

2.1 叶面施Zn对油菜地上部Cd和Zn含量的影响

叶面施Zn 对两种油菜地上部Cd 含量影响较小。由图1a 可知，寒绿在低浓度ZnSO处理下，与其对照相比地上部Cd 含量降低了8.22%，华骏在低浓度EDTA-Zn 处理下，与其对照相比地上部Cd 含量降低了7.95%，但方差分析表明，喷施Zn 肥对两种油菜地上部Cd含量均无显著影响。

叶面施Zn 显著提高了两种油菜地上部Zn 含量。由图1b 可知，ZnSO处理下寒绿和华骏的Zn 含量都显著升高（<0.05），与对照处理相比最大增幅分别为1.91 倍和2.49 倍。在高浓度EDTA-Zn 处理下，两种油菜的Zn 含量也都显著升高，增幅分别为94.32%和72.31%。

图1 不同处理下两种油菜地上部Cd和Zn含量Figure 1 Cd and Zn concentrations in the aboveground parts of two cultivars of Brassica chinenesis L.under different treatments

2.2 叶面施Zn 对油菜Cd 和Zn 的生物可给态含量和生物可给性比例的影响

本研究通过体外消化试验测定元素的生物可给态含量，该含量与元素总含量的比值即为生物可给性比例。图2a和图2b反映了不同喷施处理下两种油菜地上部Cd的生物可给态含量和生物可给性比例变化特征。从可给态含量来看，高浓度EDTA-Zn 处理显著提高寒绿和华骏地上部的可给态Cd 含量，与对照处理相比增幅分别为25.65%和49.19%，其余处理无显著影响。从生物可给性比例来看，喷施ZnSO使两种油菜的Cd 可给性比例有所降低，而喷施EDTA-Zn则使其呈现升高趋势。其中，寒绿的Cd 可给性比例在ZnSO处理下显著降低，最大降幅为24.37%；在高浓度EDTA-Zn 处理下则显著升高，增幅为20.01%；而喷施Zn 肥对华骏的Cd 可给性比例无显著影响。总的来说，喷施ZnSO明显抑制油菜Cd 的消化溶出，喷施EDTA-Zn作用相反。

图2c 和图2d 反映了油菜地上部Zn 的生物可给态含量和生物可给性比例变化特征。从可给态含量来看，喷施Zn 肥使两种油菜可给态Zn 含量呈现升高趋势，其中寒绿在所有施Zn 处理下可给态Zn 含量都显著升高，与对照相比增幅范围为0.38~1.44 倍；而华骏在高浓度ZnSO和高浓度EDTA-Zn 处理下可给态Zn 含量显著升高，增幅分别为1.87 倍和1.16 倍。从生物可给性比例来看，与Cd 相似，喷施ZnSO可使两种油菜的Zn 可给性比例有所降低，而喷施EDTA-Zn则使Zn 可给性比例呈现升高趋势。其中华骏的Zn可给性比例在高浓度ZnSO处理下显著降低，降幅为6.07%；在EDTA-Zn 处理下则显著升高，最大增幅为8.40%；而喷施Zn 肥对寒绿的Zn 可给性比例影响不显著。

图2 不同处理下油菜地上部Cd和Zn的生物可给态含量与生物可给性比例Figure 2 Bioaccessible concentrations and bioaccessibility percentages of Cd and Zn in the aboveground parts of Brassica chinenesis L.under different treatments

2.3 油菜地上部Cd和Zn的化学形态

2.3.1 油菜地上部Cd的化学形态

不同处理下两种油菜地上部Cd的化学形态含量如图3 所示。喷施EDTA-Zn 后，两种油菜地上部乙醇和HO 提取态Cd 含量均显著升高，与CK 相比分别增加了 0.87~11.16 倍和 0.74~4.48 倍；而喷施 ZnSO处理对油菜乙醇和HO 提取态Cd 含量无显著影响。对于 NaCl、HAc 和 HCl 提取态，喷施 EDTA-Zn 处理下这三种形态Cd 含量均呈现降低趋势，其中高浓度EDTA-Zn 处理下NaCl提取态Cd含量显著降低，最大降幅为70.07%；而ZnSO处理下3种形态Cd含量均无显著变化。

图3 不同处理下油菜地上部各化学形态Cd的含量（鲜基）Figure 3 Cd concentrations of different chemical forms in the aboveground parts of Brassica chinenesis L.under different treatments（fresh weight basis）

从油菜地上部Cd 化学形态占比来看（图4a 和图4b），CK处理下，两种油菜中Cd化学形态均以NaCl提取态为主，平均比例为73.71%，其次为HO 提取态，平均比例为15.89%，乙醇、HAc 和HCl 提取态比例较低，平均比例均未超过6%。喷施EDTA-Zn 后油菜乙醇和HO 提取态Cd 占比明显增加，与CK 相比最大增幅分别为25.59%和52.74%；而其余3 个形态Cd 占比有所降低，其中以NaCl 提取态降低最为明显，最大降幅可达53.59%。喷施ZnSO对油菜Cd 化学形态占比无明显影响。

图4 油菜地上部Cd和Zn的化学形态占总量比例Figure 4 Percentages of different chemical forms of Cd and Zn in the aboveground parts of Brassica chinenesis L.

2.3.2 油菜地上部Zn的化学形态

由图5 可知，喷施Zn 肥提高了两种油菜乙醇、HO和NaCl提取态Zn含量。具体来看，高浓度ZnSO处理和高浓度EDTA-Zn处理下乙醇和HO提取态Zn含量均显著升高，其中乙醇提取态增幅为0.69~1.66倍，HO提取态增幅为0.90~3.14倍。而在高浓度ZnSO处理下，两种油菜地上部NaCl、HAc 和HCl 提取态Zn含量均显著升高，最大增幅分别为3.08、2.64 倍和2.21倍。

图5 不同处理下油菜地上部各化学形态Zn的含量（鲜基）Figure 5 Zn concentrations of different chemical forms in the aboveground parts of Brassica chinenesis L.under different treatments（fresh weight basis）

如图 4c 和图 4d 所示，CK 处理下，两种油菜 Zn 化学形态占比大小顺序为：F（均值28.20%）>F（25.48%）>F（21.83%）>F（16.42%）>F（8.06%）。喷施Zn 肥对油菜各形态Zn 占比有不同影响。喷施ZnSO后两种油菜地上部乙醇提取态Zn 占比有所降低，特别是在高浓度处理下降低更加明显，最大降幅可达10.88%；而在喷施EDTA-Zn 后，寒绿和华骏的乙醇提取态Zn 占比则有所升高，最大增幅分别为9.09%和13.23%。喷施高浓度ZnSO后寒绿地上部HO 提取态Zn 占比明显升高，增幅为8.02%；而喷施高浓度EDTA-Zn 则使华骏HO 提取态Zn 比例明显升高，增幅为11.03%。喷施ZnSO使寒绿NaCl 提取态Zn 占比升高，而喷施高浓度EDTA-Zn 则使华骏NaCl 提取态Zn 比例明显降低，降幅为9.38%。喷施高浓度 EDTA-Zn 使 HAc 和 HCl 提取态 Zn 比例明显降低，最大降幅分别为11.99%和2.89%。

3 讨论

3.1 叶面施Zn对油菜地上部Cd和Zn化学形态的影响

近年来国内学者使用多种极性不同的溶剂对植物体内Cd 和Zn 的化学形态进行分级提取。其中，乙醇和HO 提取态Cd/Zn 毒性和迁移性较强，而HAc 和HCl 提取态Cd/Zn 毒性和迁移性较弱。本研究发现，在对照处理中，油菜地上部NaCl 提取态Cd 的占比最大，这与WU 等和XUE 等的研究结果一致，这表明油菜地上部的Cd 主要与蛋白质或果胶酸结合。在对照处理中，油菜地上部Zn在乙醇、NaCl以及HAc 提取态的占比相近，这与吴箐等和于方明等的研究结果一致，这表明油菜体内Zn可与硝酸根、氨基酸、蛋白质以及磷酸根等多种配体结合。

喷施 ZnSO后，乙醇提取态Zn 占比降低，NaCl 提取态比例有所升高，这与陈秀灵以及周小勇等的研究结果一致。这一变化可能是对喷施ZnSO后Zn 含量显著升高的响应，有助于减少Zn 对油菜的毒害作用。究其原因，可能是油菜通过叶面吸收SO，有助于含硫氨基酸和蛋白质的合成，进而导致蛋白质结合态即NaCl 提取态Zn 比例升高。喷施EDTA-Zn 后，乙醇和HO 提取态Cd 的含量和比例明显升高，乙醇提取态Zn 的含量和比例也明显升高，这与董如茵的研究结果一致。究其原因，EDTA 可能随Zn 一起被植物吸收，在植物体内与Zn/Cd 结合，其螯合物较为稳定，可溶性高，因此造成可溶态Cd/Zn 增加。

3.2 叶面施Zn对油菜Cd和Zn生物可给性的影响

本研究发现，喷施ZnSO降低Cd 和Zn 的生物可给性，而喷施EDTA-Zn 则提高二者的生物可给性。这一变化过程与Cd 和Zn 化学形态的变化有何关系?为探讨这一问题，我们将油菜Cd/Zn 生物可给态含量与各化学形态含量、Cd/Zn 生物可给性比例与各化学形态占比分别进行相关性分析，并在此基础上选择显著相关的指标进行线性拟合分析。

对于Cd，相关性分析显示，油菜生物可给态Cd含量与乙醇和HO提取态Cd含量呈极显著正相关（<0.01）（图 6a）；Cd 生物可给性比例与乙醇和HO 提取态Cd占比呈极显著正相关，与NaCl提取态Cd占比呈极显著负相关（图6b）。线性拟合结果表明（表1），生物可给态Cd 含量与乙醇提取态Cd 含量的回归方程决定系数（）最大，拟合效果最佳，而Cd 生物可给性比例与乙醇和HO 提取态Cd 比例之和的回归方程值最大且截距较小，拟合效果最佳。由此可知，油菜地上部乙醇和HO 提取态Cd 对生物可给态Cd 的贡献最大，这可能是由于乙醇和HO 提取态为可溶形态，理论上最易被消化溶出。另外，在Cd可给性比例与乙醇和HO 提取态Cd 比例之和的拟合方程中，其斜率明显小于1，这可能是由于小肠消化液为中性，油菜地上部可溶形态的Cd 在消化溶出过程中，部分会被消化产物（如含硫氨基酸和多糖）或消化酶所吸附或结合沉淀，从而造成Cd 的溶出比例低于可溶形态的比例。在本研究中，喷施ZnSO后，乙醇提取态Cd 含量没有显著变化，相应地生物可给态Cd 含量也没有显著变化；而在喷施高浓度EDTA-Zn 处理下，乙醇和HO 提取态Cd 的含量和比例明显升高，相应地可给态Cd 含量和Cd 可给性比例也显著升高。这些结果表明，喷施Zn 肥主要通过影响油菜地上部乙醇和HO提取态Cd来调控Cd的生物可给性。

图6 油菜Cd/Zn生物可给态含量与各化学形态含量以及Cd/Zn生物可给性比例与各化学形态占比之间的相关性分析Figure 6 Correlation coefficients for the relationship between bioaccessible Cd and Zn concentrations and Cd and Zn concentrations in different chemical forms,and for the relationship between the bioaccessibility percentages of Cd and Zn,and Cd and Zn proportions in different chemical forms in Brassica chinenesis L.

表1 油菜Cd/Zn生物可给态含量、生物可给性比例与化学形态组分的线性拟合分析Table 1 Linear correlations between bioaccessible Cd and Zn concentration,Cd and Zn concentration in different chemical forms,as well as between bioaccessibility percentages of Cd and Zn,and Cd and Zn proportions in different chemical forms in Brassica chinenesis L.

对于Zn，油菜生物可给态Zn 含量与5 个不同形态的Zn 含量均呈极显著正相关，其中与乙醇和HO提取态的相关系数较大（图6c）；线性拟合结果显示，油菜生物可给态Zn含量与乙醇和HO提取态Zn含量之和的回归方程值最大，拟合效果最佳（表1）。油菜Zn 生物可给性比例与乙醇提取态Zn 的比例呈极显著正相关，与NaCl 提取态Zn 比例呈极显著负相关，与HCl提取态Zn 比例呈显著负相关（图6d）；线性拟合分析显示，油菜Zn 的生物可给性比例与乙醇提取态Zn比例的回归方程值最大，拟合效果最佳（表1）。综合上述结果可知，油菜地上部乙醇和HO提取态Zn 对生物可给态Zn 的贡献最大。在本研究中，高浓度ZnSO和EDTA-Zn 处理下乙醇和HO 提取态Zn含量都显著升高，相应地油菜生物可给态Zn 含量也显著升高；同样地，在喷施ZnSO处理下，乙醇提取态Zn比例有所降低，在喷施EDTA-Zn处理下，乙醇提取态Zn 比例则明显升高，相应地，在ZnSO处理下油菜Zn 的生物可给性比例呈现降低趋势或显著降低，在EDTA-Zn处理下Zn的可给性比例显著升高或呈现升高趋势。这些结果表明，喷施Zn 肥主要通过调节油菜乙醇和HO提取态Zn进而影响Zn的生物可给性。