薛 晴 赵红金 代 龙 赵文鑫 王 军 朱新亮 高 鹏 张宏萌

(1. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2. 山东禹泽药康产业技术研究院有限公司，山东 德州 251200；3. 滨州医学院药学院，山东 烟台 264003；4. 山东鑫诚现代农业科技有限责任公司，山东 滨州 256600；5. 河南亚临界萃取技术研究院有限公司，山东 安阳 455000；6. 山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355)

接骨木(SambucuswillamsiiHance)为忍冬科接骨木属，主要分布于中国东北、华北及西伯利亚、俄罗斯等部分地区，是一种珍稀的野生木本油料植物，具有良好的抗炎、镇痛等作用，已被广泛应用于医药、化妆品、保健品等行业[1-3]。目前对接骨木的研究多集中在其果实、叶子、根皮与茎中的化学成分及药理作用等方面，对种子研究较少。接骨木种子油脂含量丰富，且与传统食用油相比富含多种人体必需脂肪酸，展现出良好的抗氧化、降血糖、降血脂等生物活性，是一种优质的保健食用油，具有良好的研究与开发价值[4-6]。

油脂品质是决定油脂价值的首要因素，油脂原生组成成分受其品种、产地等因素影响，但不同提取方式对油脂品质影响也较为显著，压榨法、有机溶剂提取法、亚临界萃取法、超临界CO2法等是目前植物油的普遍提取方式。压榨法操作方便，但出油率低[7]；溶剂提取法有机溶剂易残留[8]；亚临界萃取法作为新型提取方式，投资成本低，产能大，可以有效保留目标活性成分[9]；超临界提取法所得油脂品质较高，但价格昂贵[10]。因此，选择适当的提取方式是保证油脂质量的重要环节，而目前对不同提取方式影响接骨木籽油品质的研究却未见报道。

研究拟比较冷榨法、索式提取法、亚临界丁烷萃取法3种提取方式对接骨木籽油理化性质以及体外抗氧化活性的影响，并运用GC-MS联用技术对其脂肪酸成分进行定性定量分析，探究不同提取方式对接骨木籽油品质的影响，旨在为接骨木籽油的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

气质联用仪：Agilent 7890B/7000D QQQ 型，美国安捷伦公司；

万能粉碎机：YB-4500A型，永康市速锋工贸有限公司；

索式提取器：1794改良式，四川蜀玻(集团)有限责任公司；

自动快速液压榨油机：6YY-230型，山东源泉机械有限公司；

亚临界萃取试验装置：CBE-29L型，河南省亚临界生物技术有限公司；

紫外分光光度计：UV-2450型，日本岛津公司。

1.2 材料

接骨木籽：山东鑫诚现代农业科技有限责任公司；

牡丹籽油：菏泽瑞璞牡丹产业科技发展有限公司；

正庚烷：色谱纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

石油醚(30～60 ℃)：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；

无水硫酸钠、过二硫酸钾、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)：分析纯，美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 接骨木籽油提取

(1) 冷榨法：称取10 kg接骨木籽，粉碎，装入液压榨油机中，压榨头出口温度设置为50 ℃，压榨液过滤并离心(5 000 r/min)，取上层得到接骨木籽油样，装瓶密封，保存于4 ℃冰箱中，备用。

(2) 索式提取法：称取接骨木籽100 g，装入纸包，以石油醚(30～60 ℃)为提取溶剂，索式提取5 h，回收油脂，装瓶密封，保存于4 ℃冰箱中，备用。

(3) 亚临界丁烷萃取法：将粉碎后的接骨木籽样品(1 kg)置于亚临界萃取试验装置中，以丁烷为提取溶剂，使其没过物料约3 cm，调整罐内压力为0.42 MPa，提取温度44 ℃，每次40 min，共提取4次，得到接骨木籽油。

1.3.2 接骨木籽油得率计算

(1)

式中：

D——接骨木籽油得率，%；

m2——所得接骨木籽油质量，g；

m1——接骨木籽质量，g。

1.3.3 接骨木籽油理化指标测定

(1) 酸价：按GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》执行。

(2) 过氧化值：按GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》执行。

(3) 碘值：按GB/T 5532—2008《动植物油脂 碘值的测定》执行。

1.3.4 接骨木籽油脂肪酸成分

(1) 甲酯化：根据文献[11]，修改如下：取不同提取方式得到的接骨木籽油1 g，分别加入2%氢氧化钠甲醇溶液8 mL，80 ℃回流30 min，加入15%三氟化硼甲醇溶液7 mL，80 ℃水浴保温2 min，之后趁热加入饱和氯化钠水溶液5 mL，加入正庚烷10 mL，混匀后静置5 min，取上层正庚烷层，加入适量无水硫酸钠振摇1 min，静置5 min后取上层溶液，待气相色谱—质谱分析。

(2) GC条件：根据文献[11]，修改如下：HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 μm，0.25 μm)；载气：高纯度He(质量分数>99.999%)；流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃，分流比20∶1；进样量1 μL；程序升温：从80 ℃开始，以5 ℃/min升温至220 ℃，再以1 ℃/min升温至250 ℃，并以250 ℃保持10 min，随后结束测定。

(3) MS条件：根据文献[11]，修改如下：EI源；离子源温度230 ℃；电离电压70 eV；四极杆温度150 ℃；扫描质量范围35～600 (m/z)。

1.3.5 接骨木籽油体外抗氧化活性

(1) 对DPPH自由基清除作用：参考文献[12]，修改如下：精密称定3 mg DPPH固体于100 mL容量瓶，加无水乙醇溶解，超声5 min后用无水乙醇定容至刻度线，制得质量浓度为30 μg/mL (0.076 mmol/L)的DPPH溶液。以无水乙醇为溶剂，将100 μL接骨木籽油稀释至3 mL，制得接骨木籽油样品溶液。移取2 mL DPPH溶液与1 mL无水乙醇摇匀混合，常温放置30 min，在517 nm 处测量吸光度值为A0；移取2 mL DPPH溶液与1 mL样品溶液摇匀混合，常温放置30 min，在517 nm 处测量吸光度值为Ai；移取2 mL无水乙醇与1 mL样品溶液摇匀混合，常温放置30 min，在517 nm处测量吸光度值为Aj。按式(2)分别测定牡丹籽油和不同提取方法得到的接骨木籽油体积为10，20，50，100，200 μL时的DPPH自由基清除率，并利用量效关系，以接骨木籽油体积(x)和自由基清除率(y)建立回归方程，将y=50代入方程，求出DPPH自由基清除率为50%时所需样品的体积，即ED50。

(2)

式中：

y——清除率，%；

Ai——样品与DPPH自由基混合溶液的吸光度；

Aj——样品与无水乙醇混合溶液的吸光度；

A0——无水乙醇与DPPH自由基混合溶液的吸光度。

(2) 对ABTS自由基清除作用：参考文献[13]修改如下：将7.00 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L的过二硫酸钾溶液等量混匀，于暗处静置12 h，并用无水乙醇稀释，使之在734 nm处的吸光度值为0.70±0.02，制得ABTS自由基混合溶液。分别取10，20，30，40，50 μL无水乙醇与2 mL ABTS溶液摇匀混合，常温放置6 min，在743 nm处测量吸光度值为A0；将10，20，30，40，50 μL接骨木籽油分别加入2 mL ABTS溶液中，摇匀混合后常温放置6 min，在743 nm处测量吸光度值为Ai；取10，20，30，40，50 μL接骨木籽油分别加入2 mL无水乙醇溶液中，摇匀混合后常温放置6 min，在743 nm处测量吸光度值为Aj。上述试验加入接骨木籽油少于50 μL时，均用无水乙醇补至50 μL。以牡丹籽油为对照，按式(2)分别测定牡丹籽油和不同提取方法得到的接骨木籽油不同体积时的ABTS自由基清除率，并利用回归方程，求出ABTS自由基清除率为50%时所需样品的体积，即ED50。

1.3.6 数据处理与分析 采用SPSS 22.0软件对数据进行处理与分析，结果以平均值±标准偏差表示，P<0.05为显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 提取方式对接骨木籽油得率的影响

由图1可知，亚临界丁烷萃取法(28.8%)高于索式提取法(27.6%)与冷榨法(18.8%)，冷榨法得油率最低。冷榨法采用物理挤压的方式提取接骨木籽油，因此无法将油粕中的部分脂肪油榨出，存在提取不完全的缺点。索式提取法以石油醚为溶剂，提取时间长，因此提取比较完全。亚临界丁烷萃取法萃取温度低，萃取次数多，能够较好地保存接骨木籽油的原生成分，提油率最高。

图1 不同方法提取接骨木籽油的得率Figure 1 Yield of elderberry seed oils extracted by different methods

2.2 不同方式提取接骨木籽油的理化指标

由表1可知，采用亚临界萃取法得到的接骨木籽油酸价与过氧化值均为最低，索式提取法获得的接骨木籽油的酸价和过氧化值最高，推测原因可能是索式提取法提取时间长、温度高，其中不饱和酸脂肪酸物质在高温下易被氧化[14]，而亚临界丁烷萃取过程温度低，较少与氧气接触，因此过氧化值与酸价最低[15]。不同提取方式对接骨木籽油碘值影响同样显著，其中亚临界丁烷萃取法>冷榨法>索式提取法。

表1 不同方式提取接骨木籽油的理化指标†Table 1 Physicochemical indexes of elderberry seed oils extracted by different extraction methods

2.3 提取方式对接骨木籽油脂肪酸成分的影响

由表2可知，3种提取方式共检测出12种成分，其中饱和脂肪酸成分7种，占总脂肪酸组成的11.79%～18.80%；多不饱和脂肪酸2种，占总成分的71.36%～87.03%；单不饱和脂肪酸3种，冷榨法产生芥酸；三者共有成分11种。以上表明，3种提取方式下所得脂肪酸种类基本一致，但成分含量有所差异。3种方式下产生的多不饱和脂肪酸均为亚麻酸与亚油酸，α-亚麻酸为人体必需氨基酸之一，是合成长链、更多不饱和的n-3脂肪酸——二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸的前体物质，具有抗炎、抗血栓、抗心率失常、抗癌、降低血脂血压等作用，在医药、保健品等领域具有广阔的开发前景[16-17]。3种提取方式下亚麻酸含量均高于亚油酸，且不同提取方式亚麻酸含量依次为亚临界丁烷萃取法(46.94%)>索式提取法(45.50%)>冷榨法(41.22%)，亚麻酸含量丰富，表明接骨木籽油具有较高的潜在开发价值。

表2 不同方法提取接骨木籽油的脂肪酸组成†Table 2 Fatty acid content of elderberry seed oils extracted by different extraction methods

虽然3种方式提取的接骨木籽油脂肪酸组成相似，但冷榨法的检出芥酸。芥酸是存在于食用油中的一种单不饱和脂肪酸，临床研究[18]证实，芥酸能使人体心肌纤维化造成心肌病变，产生心脏脂肪沉积等问题，目前联合国粮农组织及世界卫生组织规定菜籽油中芥酸含量应低于2%，GB/T 1536—2004《菜籽油》要求低芥酸菜籽油中芥酸含量不超过3%。而通过亚临界与索式提取法提取的接骨木籽油未检测到芥酸成分，因此采用亚临界与索式提取法获得接骨木籽油的方法优于冷榨法。索式提取法的得油率和接骨木籽油脂肪酸组成虽然与亚临界丁烷提取法相近，但油的理化指标相差较大，且存在溶剂易残留等问题。亚临界丁烷提取法萃取条件温和，能够有效保存油脂原生成分，操作方便，成本投入低，产量大，是一种新型绿色工艺。

2.4 提取方式对接骨木籽油体外抗氧化活性的影响

2.4.1 DPPH自由基清除能力 如图2所示，在测试体积范围内，3种提取方式下接骨木籽油对DPPH自由基清除能力均随样品量增加而增大，且清除能力均能达到70%以上。此外，高浓度下接骨木籽油和牡丹籽油DPPH自由基清除能力较为接近，但低浓度下接骨木籽油DPPH自由基清除能力强于牡丹籽油。由表3可知，牡丹籽油和3种方法提取接骨木籽油清除DPPH自由基的ED50值分别为索式提取法(89.08 μL)>冷榨法(83.75 μL)>牡丹籽油(83.35 μL)>亚临界丁烷萃取法(79.78 μL)。说明亚临界丁烷萃取法提取的接骨木籽油对自由基的清除能力优于牡丹籽油、冷榨法与索式提取法。不同提取方法下接骨木籽油对自由基的清除能力不同，猜测与脂肪酸组成和含量差异相关，亚临界丁烷萃取法下接骨木籽油清除自由基能力最强，是提取接骨木籽油的理想方式。

图2 牡丹籽油和不同方法提取接骨木籽油清除DPPH自由基的能力Figure 2 Scavenging ability of peony seed oil and elderberry seed oils extracted by different methods on DPPH free radicals

表3 牡丹籽油和不同方法提取接骨木籽油清除DPPH自由基的ED50值† Table 3 ED50 values of peony seed oil and elderberry seed oils extracted by different methods for scavenging DPPH free radicals

2.4.2 ABTS自由基清除能力 由图3可知，接骨木籽油对ABTS自由基有很好的清除效果，清除率与样品量呈正相关，当接骨木籽油体积为50 μL时，ABTS自由基清除率高达90%，且在测试体积范围内，接骨木籽油对ABTS自由基的清除能力均明显高于牡丹籽油。由表4可知，牡丹籽油和3种方法提取接骨木籽油清除ABTS自由基的ED50值分别为牡丹籽油(23.07 μL)>索式提取法(21.04 μL)>冷榨法(18.44 μL)>亚临界丁烷萃取法(15.98 μL)，3种方法中亚临界丁烷萃取法对ABTS自由基的清除作用最强，与DPPH自由基清除作用的ED50趋势基本一致，表明接骨木籽油具有良好的体外抗氧化活性，且亚临界丁烷萃取法提取接骨木籽油品质更佳。

图3 牡丹籽油和不同方法提取接骨木籽油清除ABTS自由基的能力Figure 3 Scavenging ability of peony seed oil and elderberry seed oils extracted by different methods on ABTS free radicals

表4 牡丹籽油和不同方法提取接骨木籽油清除ABTS自由基的ED50值†Table 4 ED50 values of peony seed oil and elderberry seed oils extracted by different methods for scavenging ABTS free radicals

3 结论

研究采用冷榨法、索式提取法和亚临界丁烷萃取法对接骨木籽油的提取率、理化指标、脂肪酸组成和体外抗氧化能力的影响进行了考察。发现3种提取方式下接骨木籽油总脂肪酸组成相似，主要成分均为亚麻酸、亚油酸和棕榈酸，但在含量上存在一定差异，且冷榨法下检出芥酸。虽然索式提取法所得接骨木籽油总不饱和脂肪酸含量略高于亚临界丁烷萃取法，但亚麻酸是目前公认具有较大营养价值的不饱和脂肪酸，接骨木籽油中亚麻酸含量依次为亚临界丁烷萃取法(46.94%)>索式提取法(45.50%)>冷榨法(41.22%)；并且亚临界丁烷萃取法对接骨木籽油的提取率均高于索式提取法与冷榨法，更可以有效避免有机溶剂残留；在理化性质方面，亚临界萃取法获得的接骨木籽油酸价、过氧化值显著低于其他2种方式，碘值显著高于其他2种方式；除此之外，在体外抗氧化方面，亚临界丁烷萃取法下所得接骨木籽油相较于冷榨法、索式提取法和牡丹籽油，具有更显著的优势，表现出良好的体外抗氧化活性，均提示亚临界丁烷萃取法是接骨木籽油的一种理想提取方法。综上所述，不同提取方式对接骨木籽油的质量存在一定影响，相较于冷榨法与索式提取法，亚临界丁烷萃取法可以实现对接骨木籽油的高效、优质提取，是提升接骨木籽油营养价值和商业经济价值的有力手段。