孙 晗，谢春阳，傅俊曦，孟令志，张雅捷，夏 宁

(吉林农业大学 食品科学与工程学院,吉林 长春 130118)

黄秋葵为锦葵科秋葵属，最早的栽培技术起源于埃及，一般认为发源于非洲，是非洲和印度部分地区饮食中不可分割的一部分。因其具有促进健康的功效，在世界各地都被广泛种植并作为食品和民间药物[1～3]。黄秋葵(Abelmoschus esculentus L.Moench)，也称秋葵、羊角菜、补肾草，为一年生草本植物[4]。其嫩荚中含有大量的黏性多糖物质，主要成分包括果胶多糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖及少量糖蛋白[5,6]。此外，还含有丰富的L-半乳糖醛酸、鼠李糖、D-半乳糖和葡萄糖[7]。黄秋葵根、茎、叶、花、果实、皆可以食用，其豆荚长期以来一直被用作蔬菜和膳食药物的来源[8～10]，同时也可作为治疗痢疾，腹泻等多种疾病的传统药物[11]，主要具有促进人体消化吸收、提高免疫力、抗炎症、降血糖、抗氧化、治疗皮肤癌及降低高脂饮食诱导的肥胖等功效[12～13]。它的种子，花等部位富含类黄铜、多酚、果胶、维生素，氨基酸等营养物质，可作为功能性食品食用[14]。黄秋葵最突出的特点是粘液，可以起到促进消化、防止便秘、促进胆固醇物质排出体外、润滑关节、增强抵抗力，缓解疲劳等功效[15]，而它的豆荚常被用作为粘性食物来对抗胃炎[16]。一般来说，黄秋葵中主要能促进健康的物质称为多糖[17]，秋葵多糖是一种非凝胶性的多糖[18]可作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、黏合剂等在食品工业中应用[19～20]，且具有较强的清除自由基和抗氧化活性[21]，而秋葵凝胶是从葵花科木槿果实中提取出来的阴离子聚合物[22]。近年来主要集中在天然多糖的研究上，秋葵多糖被称为女士的手指，是一种经济型的蔬菜，在中国民间治疗利尿，胃溃疡，肠结炎[23]，具有很大的研究价值。多糖是天然大分子物质，具有多种生物活性，如抑制自由基、抗肿瘤，抗癌等，其生物性功能已成为现代化医学和食品功能化学一个关注的焦点[24～25]。

近年来，从植物、动物和微生物中提取的多糖已成为研究的一个重要领域[26]。目前，关于植物多糖的提取方法有超声提取法、水提醇沉法、微波辅助萃取法和酶法等，而超声提取作为绿色提取方法已经广泛用于加速多糖的提取过程[27]。多糖的产量往往取决于提取方法的不同，水提醇沉法耗时长，超声提取对溶剂要求相对较高，成本高[28]，相比于前两种方法，采用超声辅助水提法可弥补两者缺点。黄秋葵茎中含有大量的色素，导致提取的多糖颜色较深，因此需对秋葵多糖进行脱色处理。脱色是多糖精致的重要步骤之一，传统的吸附方法有过氧化氢吸附法，活性炭吸附法和大孔吸附树脂吸附法[29～30]。活性炭脱色法效果明显但多糖保留率相对较低，H2O2脱色效果好但容易使多糖氧化变质，大孔吸附树脂不影响多糖结构但脱色效果不如H2O2，具体应根据后期对提取多糖的应用去合理选择提取方法。新型大孔吸附树脂近几年被广泛使用研究，在多糖脱色研究上具有很好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜黄秋葵, 山东青岛；无水乙醇, 天津富宇化工；苯酚, 天津大茂试剂;

浓硫酸, 北京化工厂；无水葡萄糖, 国药试剂；D101大孔吸附树脂, 国药试剂。

1.2 仪器与设备

HX1002T电子分析天平, 慈溪市天东衡器厂；HH-2数显恒温水浴锅, 常州朗越仪器制造有限公司；L2-4K台式离心机, 安徽中科中佳科学仪器有限公司；XD-2000A型旋转蒸发仪, 上海贤德试验仪器；JY92-Ⅱ超声细胞破碎机, 宁波新芝生物科技股份有限公司；101-2A电热鼓风干燥箱, 上海一恒科技有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度光度计, 天津天泰仪器。

1.3 试验方法

1.3.1 苯酚-硫酸法测定多糖含量标准曲线 根据苯酚硫酸法测定的吸光值绘制葡萄糖标准曲线。

1.3.2 秋葵多糖提取工艺流程 新鲜黄秋葵—鼓风干燥—粉碎—过筛—超声辅助水提—离心(4 000 r/min)(取上清液)—旋蒸浓缩—无水乙醇醇沉过夜—二次离心(4 000 r/min)(弃上清液)—烘干—秋葵多糖。

1.3.3 秋葵多糖提取工艺操作要点 主要有:

原料预处理：选取新鲜饱满的黄秋葵果实，除蒂。

干燥：将新鲜黄秋葵切分成2～3 cm的小段，摆放均匀，放入鼓风干燥机，直至干燥至恒重。

粉碎过筛：利用破碎机将秋葵打粉，反复过60目筛，平均出粉率达11%

离心：将多糖溶液放入离心机内以4 000 r/s速度离心，离心后取多糖上清液

浓缩：将上清液浓缩至原体积的1/3。

二次离心：加入与浓缩液等体积的无水乙醇醇沉过夜。

式中：E-多糖得率；C-吸光值对应浓度；V-体积；N-稀释倍数；M-秋葵粉质量

1.3.5 脱蛋白处理 脱蛋白：采用sevage试剂法脱蛋白处理，配置sevage试剂(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)，置于分液漏斗中剧烈震荡直至分层，取上层液，脱蛋白过程中可脱去少许颜色。

1.4 超声辅助水提醇沉法提取秋葵多糖单因素试验

以料液比，超声时间，水提温度为单因素，进行三因素三水平响应面试验，并重复三次试验。

1.4.1 料液比试验 称取1 g秋葵多糖粉，溶于一定量蒸馏水中，当水提温度为70℃，超声时间为40 min的条件下，其料液比(g/ml)分别选取1∶35,1∶40,1∶45,1∶50,1∶55,1∶60,1∶65进行试验。

1.4.2 超声时间试验 称取1 g秋葵多糖粉，溶于一定量蒸馏水中，当水提温度为70℃，料液比为1∶50的条件下，其超声时间分别选取25 min，30 min，35 min，40 min，45 min，50 min，55 min进行试验。

1.4.3 水提温度试验 称取1 g秋葵多糖粉，溶于一定量蒸馏水中，当料液比为1∶50，超声时间为40 min，水提温度分别选取40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃进行试验。

1.5 超声波辅助水提醇沉法提取秋葵多糖响应面试验

以秋葵粗多糖得率为响应值进行三因素三水平的响应面试验，对超声波辅助水提醇沉法提取秋葵粗多糖的工艺条件进行优化。

表1 超声波提取响应面因素水平

1.6 D101大孔吸附树脂脱色方法

1.6.1 大孔树脂预处理 配置相同浓度的 NaoH溶液和 HCL溶液，分别浸泡D101大孔吸附树脂，并用蒸馏水冲洗直至树脂呈中性，真空抽气活化后备用。

1.6.2 D101大孔吸附树脂脱色单因素试验 以D101大孔吸附树脂用量，脱色时间，脱色温度为单因素，进行三因素三水平正交试验。在490 nm处测定吸光值，计算脱色率，再利用苯酚—硫酸法测定粗多糖含量，从而测定多糖保留率，并进行三次平行试验，计算误差。

1.6.3 D101大孔吸附树脂用量 配置浓度为1%的秋葵多糖溶液，并用量筒量取多糖溶液30 mL，固定脱色温度为40℃，脱色时间为2 h，设置大孔树脂用量为1%，1.5%，2%，2.5%，3%进行脱色，离心，取上清液。

1.6.4 脱色温度选择 配置浓度为1%的秋葵多糖溶液，并用量筒量取多糖溶液30 mL，固定D101大孔吸附树脂用量为2%，脱色时间2h，设置脱色温度为20℃，30℃，40℃，50℃，60℃进行脱色，离心，取上清液。

1.6.5 脱色时间选择 配置浓度为1%的秋葵多糖溶液，并用量筒量取多糖溶液30 mL，固定D101大孔吸附树脂用量为2%，脱色温度40℃，设置脱色时间为1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h，离心，取上清液。

1.7 D101大孔吸附树脂脱色正交试验

表2 D101大孔吸附树脂脱色正交试验因素水平

1.8 脱色率计算公式

式中：D2为脱色率，%；OD0为原样品的吸光值；OD1为处理后的吸光值。

1.8.1 多糖保留率计算公式 采用上述苯酚硫酸法测定多糖含量。

M=C×V×10-6

式中：M为多糖质量，g；C为多糖的质量浓度，mg/mL；V为多糖溶液体积，mL。

多糖保留率：

式中：D3为多糖保留率，%；M3为脱色后多糖含量，g；M2为样品多糖含量，g。

1.8.2 综合评分计算公式

式中：F为综合评分；D2为脱色率，%；D3为多糖保留率，%。

2 结果与分析

2.1 苯酚-硫酸法测定多糖含量标准曲线回归方程

2.2 超声波辅助水提醇沉法提取粗多糖单因素试验结果

2.2.1 超声时间对粗多糖得率的影响 由图2可知，多糖得率在超声时间为40 min时达到峰值，在25～40 min时逐步上升，在40～55 min时逐步下降，可能是因为时间过长，超声波对多糖结构产生破坏作用，从而使多糖得率下降。

图1 多糖含量测定标准曲线

图2 超声时间对粗多糖得率的影响

2.2.2 液料比对粗多糖得率的影响 由图3可知，多糖得率在液料比为50∶1(mL/g)条件下达到峰值，在35∶1～50∶1时逐步上升，在50～65min时逐步下降，可能是因为蒸馏水变多，多糖被充分溶解，但蒸馏水过多会导致秋葵中其他杂质析出，从而使多糖得率下降。

图3 液料比对粗多糖得率的影响

2.2.3 水提温度对粗多糖得率的影响 由图4可知，多糖得率在水提温度为70℃时达到峰值，在40～70℃时逐步上升，70～100℃时逐步下降，可能是因为温度上升，多糖被充分溶解，但温度过高会导致多糖结果受热变性，从而使多糖得率下降。

图4 水提温度对粗多糖得率的影响

2.3 超声波辅助水提醇沉法提取秋葵粗多糖响应面优化试验结果

表3 响应面分析结果

2.4 显著性分析结果

从表4可以看出该回归模型极显著，失拟项不显著，方程对于该试验拟合度良好，该试验方法可行。分析得出主次因素：料液比(A)>超声时间(C)>水提温度(B)。回归系数为0.9877，调整系数为0.9719，数值相近，准确性可行。建立二次回归方程：Y=6.68-0.046A+0.22B-0.14C-0.05AB+0.19AC+0.037BC-0.54A2-0.51B2-0.37C2。

表4 回归模型方差分析

显著性分析：一次项显著性分析：A影响显著，B,C影响极显著；二次项显著性分析：A2,B2,C2影响极显著；交互项显著性分析：AC影响极显著。

响应面分析结果见图5～图7。

图5 超声时间与水体温度对多糖提取率影响的响应面和等高线

图6 超声时间与料液比对多糖提取率影响的响应面和等高线

图7 水提温度与料液比对多糖提取率影响的响应面和等高线

得出结论：最优工艺条件为：水提温度68.08℃，超声时间41.05 min，液料比49.56(mL/mg)，秋葵多糖得率为6.71%。

2.5 D101大孔树脂脱色单因素试验结果

2.5.1 D101大孔树脂用量对脱色率和多糖保留率的影响 由图8可知，随着D101大孔树脂用量的增加，多糖脱色效果越来越好，但多糖保留率呈现下降趋势，可能原因是随着大孔树脂用量的增加，溶剂接触面增大，色素能够更好的被吸收，综合考虑选择最佳D101大孔树脂用量范围为1%～3%。

图8 D101大孔树脂用量对脱色率多糖保留率的影响

2.5.2 脱色时间对脱色率和多糖保留率的影响 由图9可知，随着脱色时间增加，多糖脱色效果越来越好，但多糖保留率呈现下降趋势，可能是由于时间的延长，色素和多糖长时间被树脂吸附，从而能够被更好的吸收。综合考虑选择最佳脱色时间范围为1～2 h。

图9 脱色时间对脱色率多糖保留率的影响

2.5.3 温度对脱色率和多糖保留率的影响 由图10可知，随着脱色温度的升高，色素被更好的吸收，脱色效果递增，同时多糖保留率递减，可能是由于温度升高有利于分子运动，使色素充分吸收，而保留率低可能是由于高温使多糖结构破坏，综合考虑选择最佳脱色温度范围为20～40℃。单因素脱色效果相对较低，还有一部分原因是前一部分对多糖进行脱蛋白处理过程中导致色素部分被脱去。

图10 脱色温度对脱色率多糖保留率的影响

2.6 D101大孔树脂脱色脱色正交试验结果(表6)2.7 验证试验

表6 正交试验结果

根据响应面试验结果，得出多糖得率为6.71%。进行三次验证试验，得出多糖平均得率为6.62%，树值接近，结果可靠。

根据正交试验结果，得出多糖脱色率为38.05%，保留率为90.76%。进行三次验证试验，得出多糖平均脱色率为37.88%，平均保留率为90.23%，数值接近，结果可靠。

3 结论

秋葵多糖富含丰富的营养物质，有抗氧化，抗疲劳，抗炎症、促进肠胃蠕动、润滑关节以及抗癌等多种功效，但目前国内外对于秋葵多糖的研究主要集中在多糖的抗氧化作用，多用于小鼠实验。而秋葵多糖是一种可再生并且价格便宜的可生物降解多糖，具有水溶性好、透明度高、可塑性强、黏性高的特点，所以还是一种理想的成膜原料。目前国内外对于秋葵多糖做可食膜的研究还尚未发现，因此为今后做可食膜奠定了一定的基础，具有很大的研究和应用价值。秋葵多糖是一种粘性多糖，其粘液透明度高，拉伸性好，由此做成的可食膜可以帮助解决目前可食膜拉伸性能差的特点，而利用其抗氧化性，可以将其做成抗氧化抑菌类的可食膜。由于提取的秋葵多糖颜色较深，如若后期应用于制作可食膜，为了不影响外观，需对其进行脱色处理，而目前国内外对于多糖脱色方法有三种，即活性炭、过氧化氢和大孔树脂脱色法。而对于多糖的脱色方法，国内外目前多用选用活性炭，对大孔树脂的研究相对较少。笔者选用一种新型大孔吸附树脂D101，研究它的吸附能力对秋葵多糖的脱色效果和脱色后多糖保留效果。使用大孔吸附树脂要严格注意其活化步骤，若活化不好或不完全，会严重影响其吸附色素的能力。笔者用新型大孔吸附树脂对多糖脱色工艺进行研究以及对后续用秋葵多糖制备可食膜的研究奠定了一定的理论基础。