高永钢

摘要 利用水稻 ROXY1、ROXY2基因序列，在玉米基因组数据库进行同源检索，发现 GRMZM2G442791基因（ MS22）序列与 ROXY1、 ROXY2之间具有较高的相似度（73%～79%）。以玉米 B73自交系为实验材料克隆 MS22启动子区序列;用生物信息学方法对水稻 ROXY1、 ROXY2及 MS22基因核苷酸序列以及蛋白质结构、亲水性和疏水性及进化树等进行分析。结果表明，玉米雄性核不育相关基因 MS22编码区长度为480 bp，编码159个氨基酸; ROY1编码区长度为 408 bp，编码136个氨基酸; ROXY2编码区长度为420 bp，编码140个氨基酸。通过对蛋白功能结构域进行分析发现， MS22、 ROXY1、 ROXY2都为谷氧还蛋白家族成员，具有 GRX 家族基因相似的功能结构域和近似的三级结构。因此推测， MS22可能与 ROXY1、 ROXY2具有相似的功能，可能参与氧化还原调节、植物胁迫防御，在控制雄性配子发生中起主要调控作用。

關键词 玉米;雄性不育; MS22基因;生物信息

中图分类号 S513     文献标识码 A      DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.03.009

Cloning of Maize Genic Male Sterility Gene MS22 and Bioinformatics Analysis of Its Homologous Gene

GAO Yonggang1，2

（1. Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou， Inner Mongolia 014010， China;2. College of Energy and Envi-ronment， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou， Inner Mongolia 014010， China）

Abstract  Using rice ROXY1 and ROXY2 gene sequences， a homology search was conducted in the maize genome database. the searching results showed that the GRMZM2G442791（MS22） gene sequence had a high degree of similarity with ROXY1 and ROXY2（73%-79%）. Primers were designed by using Primer5.0， and MS22 was cloned by using the maize B73 inbred line. Bioinformatics methods were used to analyze the nucleotide sequences， protein structure， hydrophilia， hydrophobicity and evolution tree of rice ROXY1， ROXY2 and MS22. The results showed that the coding regions of the maize male sterility related gene MS22， ROY1 and ROXY2 are 480 bp， 408 bp and 420 bp in length， respectively and encode 159 amino acids， 136 amino acids and 140 amino acids， respectively. The analysis of protein functions and domains showed that MS22， ROXY1 and ROXY2 are members of the glutaredoxin （GRX） family and have the similar functional domains and similar tertiary structure to GRX family genes. Therefore， it is speculated that MS22 may have similar functions to ROXY1 and ROXY2， could participate in redox regulation， plant stress defense， and play a major role in controlling male gametogenesis.

Keywords  maize; male sterility; MS22; bioinformatics

玉米是我国最重要的粮食作物之一，其产量的提高主要依赖于杂种优势的利用。玉米核雄性不育（ Genic male sterility）是由细胞核基因突变导致的雄性败育现象，表现为植物有性生殖过程中不能产生正常的花药、花粉或雄配子而雌蕊功能正常的遗传现象[1]。玉米雄性不育基因的克隆不仅有助于解析玉米花药发育的分子机理，同时也为玉米杂交种的生产提供理论支撑。玉米目前是国际上第一大粮食作物，玉米商业杂交种质量直接影响玉米的产量和品质。细胞质雄性不育系在抗病性、育性遗传等方面存在诸多不确定性和干扰因素。近些年有关学者将目光再次集中于受环境影响较小、遗传较为稳定且持续的细胞核雄性不育[2-4]。

迄今，国内外已经发现了200多个玉米雄性不育突变体，大部分为隐性核不育突变体，其中，部分完成了染色体的初步定位和细胞学分析，仅有少数基因完成了分离克隆。目前已经克隆的玉米隐性核不育基因有12个，包括 ms1、ms7、ms8、 ms9、 ms22/msca1、 ms23、 ms26、 ocl4、 mac1、 ms30、 ms32和 ms45[5-6]。

谷氧还蛋白（ GRX）是参与各种细胞过程的小型氧化还原酶，并在氧化应激反应中发挥重要作用。前人报道称，2个 CC 型 GRX 基因 ROXY1和 ROXY2一起控制拟南芥中的花药发育[7]。 ROXY1和 ROXY2是 CC 型花谷氧还蛋白，在拟南芥花药发育中具有调控功能。 ROXY1在高等植物中编码谷氧还蛋白亚基，这类蛋白调节植物花器官发育， ROXY1蛋白中保守的谷胱甘肽结合甘氨酸的诱变，表明 CC 型 GRX 需要与谷胱甘肽相互作用以催化必要的生物合成反应[8-9]。 roxy1和  roxy2的单突变体可育并产生正常的花药;然而， roxy1、 roxy2双突变体是不育的，不产生花粉。研究表明， ROXY1和 ROXY2在花药发育过程中以复合模式表达， ROXY1和 ROXY2功能的缺乏在转录水平影响大量花药基因，控制绒毡层发育。对 ROXY1和 ROXY2的分析表明，该类基因可能参与氧化还原调节、植物胁迫防御，在控制雄性配子发生中起主要作用[10-11]。

本研究在玉米基因组数据库（ https ：//maizegdb.org/）中对水稻 ROXY1和 ROXY2基因序列进行同源比对、检索，获得玉米 GRMZM2G442791基因序列;经基因克隆、测序、序列分析后，运用生物信息学手段对该基因及 ROXY1和 ROXY2进行分析。

1 材料与方法

本实验所用材料为玉米 B73 自交系，由实验室盆栽种植，待玉米生长至 V3时期，取幼嫩叶片提取基因组 DNA，用于 MS22基因的扩增。

通过 NCBI 检索 ROXY1和 ROXY2基因序列，在玉米基因组数据库进行序列同源比对。利用expasy數据库（http：//www.expasy.org /tools / protparam.html）对基因的理化性质、结构和功能域进行序列分析预测。通过InterPro（ http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）对 ROXY1和 ROXY2全长 cDNA 序列编码的氨基酸序列和玉米 MS22全长 cDNA 序列编码的氨基酸序列进行结构分析。用 SOPMA（http：//npsa- pbil.ibcp.fr/cgi- bin/=/ NPSA/npsa_sopma.html ）对 MS22、 ROXY1 和 ROXY2基因编码蛋白质产物的二级结构进行分析。利用Phyre（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre/）程序对 MS22、 ROXY1和 ROXY2基因编码蛋白质产物进行三级结构预测，并利用Rasmol软件对三级结构进行图形化分析。用Clustal X 对蛋白质多重序列进行比对。利用 Primer 5.0软件进行引物设计，取玉米新鲜幼嫩的叶片，采用 CTAB 法提取玉米基因组 DNA;利用 Power  pol 2×PCR Mix 进行 PCR 扩增。胶回收试剂盒、大肠杆菌 DH5α、 DNA marker、 Simple -Blunt Peasy-T 载体等购自上海生物工程股份有限公司。所用引物由上海生工负责合成（表1）。

2 结果与分析

2.1 玉米 MS22启动子克隆

玉米 MS22基因位于玉米第7 条染色体（ Chr7：5333364..5334245）短臂，通过 Primer 5.0进行引物设计，提取 B73材料幼嫩叶片的 DNA，进行 PCR 扩增，得到长度为1523 bp 的序列，见图1。

通过对目的片段进行凝胶回收及连接转化，挑取单菌落经菌落 PCR（图2）鉴定正确后测序，对测序成功的序列进行比对分析。

2.2  ROXY1、ROXY2与 MS22基因功能结构及理化性质分析

以 MS22、ROXY1、ROXY2的氨基酸序列为模板，在 NCBI 网站中对其进行基因结构域分析，发现3个蛋白均属于硫氧还蛋白超级家族，并具备该家族典型的保守结构域及相关功能位点（图3）。

利用expasy数据库 tools-protparam在线程序对 MS22、 ROXY1、 ROXY2的理化性质进行分析，结果发现， MS22和 ROXY2为疏水性蛋白，其亲水指数分别为0.496和0.474;而 ROXY1为亲水蛋白，其亲水系数为0.604，3个蛋白的具体理化性质见表2。

2.3 蛋白序列及保守结构域分析

对 MS22、 ROXY1、 ROXY2进行氨基酸序列比对发现， MS22与 ROXY1、ROXY2在第50个氨基酸之后具有较高的匹配度。这一区段也正是 GSH 转移酶（ GST， N 端结构域）活性位点结合区段，该区段有谷氧还蛋白家族（ GRXs ）特有的结构域，具有氧化还原活性 CXXC 的保守基序。

玉米的 MS22与其他植物的 GRX 类蛋白一样具有谷氧还蛋白的特殊结构域。玉米的 MS22基因属于谷氧还蛋白家族中Glutaredoxin–C9的成员。利用在线结构预测分析软件 MEME3.0对玉米的 MS22、ROXY1、ROXY2基因的氨基酸序列进行分析发现，3个基因均具有 GRX 类蛋白典型的保守结构域（图4）。

利用在线网站 http：//meme-suite.org/分析 Glutaredoxin-C9-like 蛋白的保守基序，在氨基酸序列的第49～97的位点处有一个含有49个氨基酸残基的保守基序 motif。分析发现，该类蛋白的氨基酸序列包含 GRX 基因家族特有的活性位点结构域： CY LV C 或者 CMR K S 的保守基序，CXXC 与 CXXS 为该类群蛋白质的特征标志（图5）。保守结构域分析发现，玉米 MS22属于谷氧还蛋白亚类 III，结构域分析发现，该蛋白具有 GRX-subIII的CCx[C/S/GI]典型活性位点。

2.4  MS22及同源基因的蛋白结构预测

采用在线分析软件 Swiss-Model （ http ：//swissmodel.expasy.org/）预测玉米 MS22基因的蛋白三级结构。 MS22蛋白的三级结构主要以α-螺旋、β-转角、无规则卷曲及延伸结构为主。如图6所示， a-螺旋为蓝色，不规则卷曲为黄色，延伸链结构为红色，β-转角为绿色，玉米 MS22蛋白的三维结构组成以α-螺旋、不规则卷曲、延伸结构为主。应用 SOPMA 软件预测 MS22蛋白的二级结构，其中α-螺旋占38.12%、β-转角占14.37%、延伸链占21.25%、无规卷曲占26.25%。

利用Ensembl  Genomes 网站（http：//ense- mblgenomes.org/）检索玉米的 zm00001d018802。结果发现，玉米 MS22有37个直系同源物种基因和19个旁系同源物种基因（图7）。主要包括的农作物有小麦、大麦、水稻、大豆、高粱、谷子等，此外还有苜蓿、卷柏、樟子松、葡萄等。分析发现，这类基因主要存在于陆生禾本科开花植物中，在植物中主要对电子载体活性及蛋白质二硫氧化还原酶活性起调控作用。

3 讨论与结论

GRXs 蛋白是一类小分子氧化还原酶，是一类约包含 100个氨基酸残基及氧化还原活性 CXXC 结构的小分子蛋白;该类蛋白主要在植物中调节氧化还原代谢反应及相关通路信号的识别;该类基因在拟南芥、水稻、高粱、玉米、谷子及一些花卉植物、蔬菜中以不同的作用形式存在[12-15]。研究发现，玉米 MS22、水稻 ROXY1、 ROXY2蛋白均属于硫氧还蛋白超级家族中谷氧还蛋白家族（ GRXs）成员，该类蛋白目前已经被证实参与植物不同的细胞代谢过程，例如植物的氧化胁迫、干旱、盐害、高温、冷害、重金属等抗性，植物个体对一些真菌类病原菌的抗性水平方面[16-18]。

本研究对水稻 ROXY1、ROXY2及玉米 MS22 的 DNA 序列、氨基酸序列进行比对发现， MS22、 ROXY1、ROXY2具有较高的序列相似性，其在基因結构、保守基序、功能结构域上都具有 GRXs 蛋白家族典型的基因结构。说明 MS22在植物中不仅可导致玉米雄性不育发生，而且在不同植物、不同生育时期，其功能类似于同为禾本科作物水稻 ROXY1和 ROXY2等其他 GRXs 类蛋白家族成员，调节蛋白质的氧化还原状态、抵御不同生物（非生物）逆境环境胁迫条件，参与植物不同器官的生长发育调控过程。本研究对玉米雄性核不育基因 MS22有进一步的认识，对其他作物中该类型基因的研究具有一定的理论参考价值。

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（責任编辑 林海妹）