蔡昕原，申文盛，马 丽，刘向荣，吴 燕，赵顺省，杨再文

(1.西安科技大学 化学与化工学院，陕西 西安 710054；2.自然资源部煤炭资源勘查与综合利用重点实验室，陕西 西安 710021)

0 引 言

富油煤的焦油产率大于7%，主要赋存于中低阶煤类中，是一种宝贵的煤基油气资源[1-2]。目前主要采用传统的热转化方式提取焦油和其他高附加值化学品，但热转化技术因设备复杂、能耗高、污染大等原因，未能在工业上大规模利用[3-5]。

FAKOUSSA和COHEN认为微生物能在煤上生长，并产生黑色液体，这意味着微生物可将煤由固相转化为液相，分离并加工成精细化学品和液体燃料等[6-7]。煤的微生物转化过程通常在常温、常压下进行，条件温和、能耗低、设备简单，被认为是煤炭绿色转化的途径之一[8-13]。但是，微生物对煤的降解率低限制了其在工业上的推广[14-16]。影响煤降解率的因素有煤种、菌种、煤的预处理方法、降解方式、添加表面活性剂等，其中添加适合的表面活性剂是一种较为有效的方法[17]。YIN等利用表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)改善了菌种对煤的吸附，提高了抚顺褐煤的微生物溶解度[18]。袁红莉等发现斜卧青霉P6分泌的生物表面活性剂可以促进褐煤的液化[19]。POLMAN和STRANDBERG等研究表明，煤、表面活性剂与菌种的相互作用是微生物增溶的主要原因，表面活性剂不直接溶解煤[20-21]。笔者也进行了相关探索实验，发现表面活性剂直链烷基苯磺酸盐(LAS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)均能提高神木褐煤的微生物降解率，其中Triton X-100的作用效果最好，使降解率提高到61.9%[22]。因此，深入研究表面活性剂在微生物降解煤过程中的促进作用，将会推动煤生物降解的工业化进程。

笔者利用金雀儿根瘤苍白杆菌降解陕北富油煤，通过单因素试验、正交试验探究了加煤量、接种量、降解时间对微生物降解煤样的影响，得到最佳降解工艺条件。选择三种表面活性剂SDS，LAS和Triton X-100，研究添加表面活性剂后，金雀儿根瘤苍白杆菌对陕北富油煤降解能力的变化规律和降解液相产物的组成。

1 实验

1.1 煤样

实验所选的煤样是陕北李家畔富油煤。将煤样进行破碎、研磨、筛分，选取0.25～0.5 mm煤样(原煤)。用硝酸对煤样进行氧化预处理(氧化煤)[23]。煤样经硝酸预处理后，灰分含量较原煤减少，挥发分较原煤增加，氧含量明显增加，硫含量减少(表1)，与文献报道一致[24]，这有利于微生物对煤的降解。

表1 煤样的工业分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analysis of coal samples %

1.2 菌株与培养基

所用菌种为金雀儿根瘤苍白杆菌对低阶煤有较好的降解性[23]。菌种购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，编号为：23890，采用营养肉汁琼脂培养基进行菌种培育[15]。

1.3 工艺条件优化实验

1.3.1 微生物降解实验

将20 mL液体培养基接入150 mL锥形瓶，加入煤样，灭菌冷却后接入菌种，于30 ℃，160 r/min条件下振荡培养，中间不断取样将菌丝与煤样分离，测定煤样降解效果。总培养时间为20 d，每个实验做3组平行实验。

1.3.2 降解效果评价和降解率计算

1)降解效果评价[25]。培养结束后，对黑色降解液离心，过滤，以去离子水为参比，利用紫外可见分光光度计测定黑色降解液在450 nm处的吸光度(A450)，通过A450的值来对微生物降解煤的效果进行评价，A450值越大，表明降解效果越好。

2)降解率计算。降解结束将煤样与培养液和菌丝分离，80 ℃烘干测定未降解煤样(剩煤)质量，然后计算降解率η，即

式中η为降解率，%；m1为起始加入的煤样质量，g；m2为细菌作用后剩煤质量，g。

1.3.3 单因素试验

在1.3.1实验条件下，分别研究加煤量(0.3,0.5,0.7,0.9 g/50 mL)、接种量(5,10,15,20,25,30 mL)、降解时间(3,6,9,12,15,18 d)对煤样降解效果的影响。

1.3.4 正交试验

利用L9(3×3)正交设计表，对金雀儿根瘤苍白杆菌降解煤样的工艺条件进行正交设计。取加煤量、接种量和降解时间3个因素，各因素分为3个水平，各因素间的交互作用不作考虑(表2)。

表2 因素水平表Table 2 Factor levels

1.4 表面活性剂对微生物降解煤过程的影响

在单因素、正交试验基础上获得微生物降解煤样的最佳工艺，在同等实验条件下，灭菌前加入50 mL浓度为0，100，200，300，400，500，600，700，800，900 mg/L的SDS液体，研究不同浓度SDS对降解率的影响。测定经离心处理后的液相降解产物的A450值。采用同样实验方法研究LAS，Triton X-100对微生物降解煤样的影响。

1.5 降解液相产物分析

依据1.4的实验结果，确定出对金雀儿根瘤苍白杆菌降解煤起最大促进作用的表面活性剂，通过离心分离得到在最优表面活性剂添加下的降解液相产物，再利用3种不同极性的有机溶剂甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，最后采用安捷伦7890A/5975C型气象色谱-质谱联用仪进行液相产物的组成分析。

2 结果与讨论

2.1 工艺条件优化

2.1.1 单因素试验结果

加煤量、接种量和降解时间对降解液吸光度的影响分别如图1、图2和图3所示。随着加煤量增加，降解液的A450值先增加后降低，加煤量为0.5 g/50 mL时，A450值达到最大(图1)。原因可能是加煤量小于0.5 g/50 mL，菌体生存环境好，能有效降解煤样；而加煤量大于0.5 g/50 mL，细菌生长环境变差，生长繁殖受限，不能很好地以煤为碳源生长。

图1 加煤量对降解液吸光度的影响Fig.1 Effects of coal amount on A450 of degradation liquids

随着接种量的增大，A450值先增大后趋于稳定(图2)，接种量为15 mL/ 50 mL时，A450值达到最大，再增加接种量时，A450值变化甚微。这是因为煤样表面是固定的，当接种量达到15 mL/ 50 mL时，煤样与菌种接触面达到饱和，新增加菌种不能与煤接触，降解效果变化甚微。

图2 接种量对降解液吸光度的影响Fig.2 Effects of inoculation size on A450 of degradation liquids

培养时间为15 d时，降解液A450值达到最大，15 d后波动较小(图3)。原因可能是菌种生存依赖于培养基，降解时间超过15 d时，培养基中的营养成分耗尽，菌种停止代谢，煤样不能继续降解。

图3 降解时间对降解液吸光度的影响Fig.3 Effects of degradation time on A450 of degradation liquids

2.1.2 正交试验结果分析

金雀儿根瘤苍白杆菌降解煤样的3个影响因素A,B,C对应极差R分别为0.272,0.034,0.056，即A>C>B，可以得出加煤量(因素A)对降解效果影响最大，降解时间(因素C)次之，接种量(因素B)相对较小。此外，因素A所对应A450值的3个均值K1，K2，K3最大值为0.436，因素B为0.309，因素C为0.319，得出最佳工艺为A3B3C3。即加煤量为0.7 g/50 mL，接种量为20 mL/50 mL，降解时间为18 d(表3)，此时降解效果最好，降解率为17.1%。

表3 试验结果的方差分析Table 3 Variance analysis of test results

2.2 表面活性剂对微生物降解煤的影响

随着3种表面活性剂浓度的增大，SDS作用下降解液A450值变小，LAS作用下降解液A450值先增加后趋平，Triton X-100作用下降解液A450值与LAS作用趋势类似(图4)。表明SDS对金雀儿根瘤苍白杆菌降解煤样具有抑制作用，而LAS和Triton X-100具有促进作用。

图4 3种表面活性剂浓度对降解液A450的影响Fig.4 Effects of concentrations of three surfactants on A450 of degradation liquids

在Triton X-100作用下降解液A450值大于同浓度LAS试验组，Triton X-100加入浓度为800 mg/L时，降解液A450值达到最大值，微生物降解煤样效果最好。Triton X-100加入后降解率为34.1%，比空白组增加了将近一倍(表4)。

表4 Triton X-100对降解率的影响Table 4 Effect of Triton X-100 on degradation rate

康红丽等研究SDS，LAS和Triton X-100对金雀儿根瘤苍白杆菌生长过程的影响(图5)所示[22]。在不加表面活性剂时，金雀儿根瘤苍白杆菌在第1天的生长速率最快，2 d时就达到了生长的最高峰，这意味者该细菌在2 d内的降解能力较强，尤其是第1天，细菌的活性和降解能力更强。当添加LAS和Triton X-100后，细菌的生长趋势基本没变，也就是说LAS和Triton X-100基本不影响细菌的生长。但是，添加SDS后，金雀儿根瘤苍白杆菌在起始期的生长基本被抑制，2 d后才快速生长，错过了其降解煤的最佳时间。这个实验结果在一定程度上佐证了图4的结论。

图5 3种表面活性剂对金雀儿根瘤苍白杆菌生长过程的影响Fig.5 Effects of three surfactants on the growth processes of ochrobactrum cytisi

2.3 表面活性剂作用下微生物降解煤样液相产物分析

相对其他2种表面活性剂，TritonX-100对于对金雀儿根瘤苍白杆菌降解煤的促进作用最大，并且当Triton X-100加入浓度为800 mg/L时，降解率最大(图4、表4)，因此，选取此时的降解液相产物，分别用甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取，萃取物主要组成见表5～表7。甲苯萃取液相产物检测到24种化合物，相对分子量在134～422之间，组成为烷烃类物质(72.57%)，芳香化合物(14.99%)，羧酸类、酯类(12.44%)(表5)。二氯甲烷萃取液相产物共检测出22种化合物，相对分子量在142～437之间，萃取物中主要含有烷烃类(93.10%)和酯类(5.76%)，其中8号(二十五烷)含量为18.34%，14号(正二十七烷)含量为11.29%，16号(二十二烷)含量为16.41%(表6)。由表7可知乙酸乙酯萃取液相产物共检测到11种化合物，相对分子量在142～390之间，邻苯二甲酸二丁酯的含量高达71.03%。总之，金雀儿根瘤苍白杆菌降解煤样的液相产物种类比较丰富，含有烷烃、羧酸类、酯类、芳香化合物，相对分子量在134～437之间。烷烃类物质是常用的工业燃料，二十二烷、二十五烷可制作润滑剂和防腐剂，邻苯二甲酸二丁酯可用于硝化纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯等的增塑剂。

表5 甲苯萃取物中液体产物的主要化合物Table 5 Main compounds of liquid products in the toluene extract

表6 二氯甲烷萃取物中液体产物的主要化合物Table 6 Main compounds of liquid products in the dichloromethane extract

表7 乙酸乙酯萃取物中液体产物的主要化合物Table 7 Main compounds of liquid products in the ethyl acetate extract

目前文献报道表明SDS，LAS和Triton X-100都能降低微生物菌种和煤接触时的界面张力，有利于菌种降解煤[18-22]。然而文中SDS对于金雀儿根瘤苍白杆菌的起始生长期抑制作用较大，降解率表现出降低的现象。因此，表面活性剂对于煤的微生物降解的影响取决于表面活性剂对于煤和微生物界面张力的影响以及对于微生物生长的影响，是这两方面综合的结果。另外，表面活性剂虽然能够促进煤和微生物的相互吸附，影响微生物的生长和分泌物的数量，对于煤的降解速率和产率影响较大，但不能改变煤的结构和微生物分泌物的组成，对于煤微生物降解产物的组成影响不大。

3 结 论

1)金雀儿根瘤苍白杆菌降解煤样过程中加煤量对降解效果影响最大，降解时间次之，菌液用量影响最小。加煤量为0.7 g/50 mL，接种量20 mL/50 mL，降解时间为18 d，降解效果最好，降解率为17.1%。

2)SDS对金雀儿根瘤苍白杆菌降解煤样有抑制作用，LAS和Triton X-100有促进作用，Triton X-100增加效果最为明显，降解率为34.1%。

3)金雀儿根瘤苍白杆菌对煤样的降解液相产物种类比较丰富，含有烷烃、羧酸类、酯类、芳香化合物，相对分子量在134～437之间。利用微生物降解富油煤制备精细化学品，是富油煤清洁高效利用的有效途径之一。