霍明洋 ， 何嘉宇 ， 谭振宇 ， 陈 响 ， 唐 宁 ， 胡莲薪 ， 郗艳丽

(吉林医药学院公共卫生学院 ， 吉林 吉林 132013)

熊果酸(Ursolic acid)，又名乌索酸，属于α-香树脂醇(α-amyrin)型五环三萜类化合物，在自然界分布广泛，在玄参科植物毛泡桐的叶[1]、蔷薇科植物乌梅的果[2]、山茱萸科山茱萸果核[3]、木犀科植物女贞的果实和叶[4]、茜草科植物栀子果实[5]、紫葳科植物毛子草的地上部分[6]、目唇形科植物夏枯草果穗[7]、唇形科植物迷迭香叶[8]、冬青科冬青属植物苦丁茶的叶[9]、蔷薇科植物山楂的果[10]、忍冬科植物陆英的花和果实[11]、车前科植物车前草的根、茎和叶[12]、唇形科香茶属冬凌草地上部分[13]等植物中均检测到了含量丰富的熊果酸。研究表明，熊果酸具有抗肿瘤[14]、抗炎[15]、镇静[16]、抗菌[17]、预防心血管疾病[18]、改善银屑病样皮损[19]等功效。体外研究发现，熊果酸能有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基[20-21]。体内研究发现，苦丁茶中的熊果酸能显著降低四氯化碳引起的小鼠肝组织超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)水平降低[22]。这表明熊果酸具有非常好的抗氧化能力。但目前关于熊果酸能否作为保健食品，应用于健康机体，有效提高机体的抗氧化能力，延缓机体衰老或者组织衰老等方面鲜有报道。本试验通过熊果酸连续灌胃的方式，观察其对健康ICR小鼠肝、肾和结肠组织抗氧化能力的影响，为熊果酸应用领域的拓展提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 ICR小鼠，清洁级，18～22 g，雌雄各半，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物合格证号：SCXK(吉)—2018—0007。饲养于吉林医药学院实验动物中心，实验动物使用许可证号：SCXK(吉)2017—0002。基础饲料喂养，饲料购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK(吉)—2015—0005。饲养条件：温度18～22 ℃，湿度45%～65%，12 h明暗交替。所有试验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》和《动物毒理学使用原则》进行，并经吉林医药学院医学伦理委员会批准(许可证号：2018LW011)。

1.1.2 药品试剂 熊果酸(上海麦克林生化科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢(Hydrogen peroxide，H2O2)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)、脂质过氧化物(Lipid peroxidation，LPO)和蛋白定量检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3 仪器 Epoch多功能酶标仪(美国BioTek)；NIU科研级正置荧光显微成像系统(美国Nikon)；QUINITIX124-1CN电子天平(美国塞多利斯)。

1.2 方法

1.2.1 试验分组及给药 ICR小鼠50只，雌雄各半，随机分为5个组，即空白对照组、溶剂对照组、熊果酸低、中和高剂量组[5、10 mg/(kg·bw)和15 mg/(kg·bw)]。除空白对照组和溶剂对照组，各组均给予熊果酸混悬溶液(熊果酸溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，现用现配，超声混匀)灌胃，连续28 d，1 次/d，空白对照组给予相同体积的生理盐水灌胃，溶剂对照组给予相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。

1.2.2 抗氧化酶和氧化损伤标志物的测定 切取结肠组织，清理内容物。切取相同部位的结肠、肝组织或者肾组织，用生理盐水在冰浴下制成10%组织匀浆，4 ℃，3 000 r/min离心10 min，取上清严格按照试剂盒说明书测定结肠组织中POD、CAT、SOD、H2O2、MDA、GSH-Px、LPO、T-AOC、NO和NOS的含量。

2 结果

2.1 熊果酸对小鼠结肠组织抗氧化酶含量的影响 结果如表1所示：随着熊果酸剂量的增加，小鼠结肠组织中POD、CAT、SOD、GSH-Px、T-AOC和LPO的含量逐渐降低，NOS含量逐渐升高。熊果酸高剂量组雄性小鼠结肠组织中POD含量显著低于溶剂对照组和低剂量组(P<0.05)。熊果酸低剂量组雄性小鼠结肠组织中SOD含量显著高于空白对照组(P<0.05)。熊果酸中剂量组和高剂量组雄性小鼠结肠组织中T-AOC含量显著低于空白对照组(P<0.05)。熊果酸高剂量组雌性小鼠结肠组织中POD含量显著低于空白对照组、溶剂对照组、低和中剂量组(P<0.05)。熊果酸低剂量组雌性小鼠结肠组织中LPO含量显著高于空白对照组和溶剂对照组(P<0.05)。

表1 熊果酸对小鼠结肠组织抗氧化酶含量的影响Table 1 Effects of ursolic acid on antioxidant enzyme contents in colon tissue of mice

2.2 熊果酸对小鼠结肠组织中NO、H2O2和MDA含量的影响 结果如表2所示：随着熊果酸给药剂量的增加，NO、H2O2和MDA含量逐渐升高。与空白对照组比较，高剂量组雄性小鼠结肠组织中H2O2水平显著升高(P<0.05)，高剂量组雌性小鼠结肠组织中MDA含量显著升高(P<0.05)。与空白对照组、溶剂对照组和低剂量组比较，高剂量组雌性小鼠结肠组织中H2O2水平显著升高(P<0.05)。

表2 熊果酸对小鼠结肠组织中NO、H2O2和MDA含量的影响Table 2 Effects of ursolic acid on NO,H2O2 and MDA contents in colon tissue of mice

2.3 熊果酸对小鼠肝组织中抗氧化酶和氧化损伤标志物含量的影响 结果如表3所示：随着熊果酸剂量的增加，小鼠肝组织中GSH-Px、CAT、POD和SOD的含量逐渐增加，而MDA和H2O2的含量则逐渐降低。熊果酸高剂量组雄性小鼠肝组织中H2O2含量显著低于空白对照组、溶剂对照组、低剂量和中剂量组(P<0.05)，而POD含量则显著高于空白对照组、溶剂对照组、低剂量组和中剂量组(P<0.05)。熊果酸低剂量组雌性小鼠肝组织中H2O2和MDA水平显著高于空白对照组和溶剂对照组(P<0.05)，熊果酸中和高剂量组雌性小鼠肝组织中H2O2和MDA水平显著低于低剂量组(P<0.05)。熊果酸高剂量组雌性小鼠肝组织中POD水平显著高于溶剂对照组、低剂量组和中剂量组(P<0.05)。

表3 熊果酸对小鼠肝组织中抗氧化酶和氧化损伤标志物含量的影响Table 3 Effects of ursolic acid on the levels of antioxidant enzyme and oxidative damage markers in liver tissue of mice

2.4 熊果酸对小鼠肾组织中抗氧化酶和氧化损伤标志物含量的影响 结果如表4所示：随着熊果酸剂量的增加，各剂量组小鼠肾组织中GSH-Px、CAT、POD和SOD含量逐渐升高，而H2O2和MDA含量逐渐降低。与空白对照组和溶剂对照组比较，熊果酸高剂量组雄性小鼠肾组织中POD含量显著升高(P<0.05)。与空白对照组、溶剂对照组、熊果酸低和中剂量组比较，高剂量组雄性小鼠肾组织中MDA含量显著降低(P<0.05)。熊果酸低剂量组雌性小鼠肾组织中H2O2含量显著高于空白对照组和溶剂对照组(P<0.05)。中剂量组雌性小鼠肾组织中POD含量显著高于空白对照组(P<0.05)，高剂量组雌性小鼠肾组织中POD含量显著高于空白对照组、溶剂对照组和熊果酸低剂量组(P<0.05)。熊果酸各剂量组雌性小鼠肾组织MDA含量显著低于空白对照组(P<0.05)。

表4 熊果酸对小鼠肾组织中抗氧化酶和氧化损伤标志物含量的影响Table 4 Effects of ursolic acid on the levels of antioxidant enzyme and oxidative damage markers in kidney tissue of mice

3 讨论

现代研究发现，衰老不仅局限于老年人，人类衰老的进程自胚胎发育期已经开始[23]，就临床角度而言，衰老可以发生在任何年龄阶段。衰老除了表现为形体外貌的改变，还可表现为内在组织器官形态结构的改变。在伴随组织器官老化的过程，其功能亦会发生相应的衰退，从而引发相关疾病。中医理论认为，组织器官的衰老以虚证为主，其中肾阳虚证分布最广[24]。肝虚证可包括肝阳上亢证、肝肾阴虚证、肝血虚证、肝气虚证等，临床上可表现为头晕、耳鸣、心悸、目胀痛、口干、口苦、恶心、头痛、头昏、呕吐、消瘦、大便干燥、纳呆、沉默寡言、腰痛等症状。肾虚包括肾阳虚证、肾气虚证、肾阴虚证、肾精虚证等，临床上可表现为乏力、浮肿、心悸、畏寒、咳嗽、纳呆、气短、四肢冷、头晕、腰酸、神疲、腹胀、尿频、耳鸣、口干、咽干、大便干燥、失眠等症状。

组织器官发生衰老的重要机制之一就是自由基学说。机体内过多的活性氧(ROS)会导致组织器官中的抗氧化酶活性降低，进而形成更多的自由基产物，引起细胞损害，导致机体中许多组织器官出现功能性衰老。抗氧化酶和抗氧化剂是机体内清除自由基的主要物质。适当补充抗氧化剂，不仅可以清除体内过多的自由基，还有利于疾病的防控。如果摄入的抗氧化剂能有效清除自由基的同时，提高体内抗氧化酶的活力，必将有利于机体健康水平的提高，延缓衰老。具有清除自由基能力的天然抗氧剂已成为国内外医学、生物学、食品科学等领域研究的热点。

熊果酸是一种存在于多科植物中的五环三萜类化合物，常以游离或结合成糖苷的形式存在于多种植物中，其抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血脂、降低血糖、保肝、抗菌、抗炎、镇定和安定等药理作用已被证实，且不良反应小，生物安全性高[25]。熊果酸能有效清除自由基，是一种抗氧化性能非常好的天然抗氧化剂[26]。我国有丰富的中医药资源，许多常见中药材中均可提取出熊果酸，其市场应用前景广阔。深入研究熊果酸对健康机体抗氧化能力的影响，对其在延缓机体或组织器官衰老方面的应用具有十分重要的意义。

本试验使用的熊果酸灌胃剂量范围为5～15 mg/(kg·bw)，这与熊果酸口服生物利用度低有关。田娟报道人口服熊果酸后，其吸收呈非线性特征，在40～80 mg/(kg·bw)剂量范围内，机体对熊果酸的吸收会随剂量的增加而增加；当剂量高于80 mg/(kg·bw)时，机体对熊果酸的吸收呈饱和状态，这可能与熊果酸在肠道会被主动外排转运有关[27]。熊果酸进入肠道系统后，会被肠道黏膜中的外排蛋白排到肠腔，导致肠道系统对熊果酸的吸收差[28]。

本试验发现，熊果酸灌胃后，ICR小鼠的结肠组织表现出了一定的毒性作用。通过对结肠组织匀浆的检测发现，小鼠结肠组织的抗氧化酶活力出现降低，如POD、CAT、SOD、GSH-Px、T-AOC和LPO，而代表细胞氧化损伤的物质MDA、H2O2和NO的水平则出现升高的趋势。但这种损伤并不十分显著。从结果推测，这种改变可能是一种可逆性变化，是由于肠道系统大量摄入外源化学物质所致。停药后，肠道系统的这种变化可能会缓解。该推测有待后续试验进一步论证。

熊果酸的生物利用率较低，可通过被动扩散方式被肠道组织吸收，熊果酸在小鼠体内组织分布呈显著差异，其中肝肾组织中熊果酸浓度随时间延长而逐渐升高，但肾组织中药物浓度显著低于肝组织[28]。这表明熊果酸主要通过肝组织代谢，而肾组织仅可排泄极少量的熊果酸原药。本试验发现，给予健康ICR小鼠熊果酸灌胃后，小鼠肝组织和肾组织的抗氧化能力显著提高。这间接论证了熊果酸具有保肝护肾的功效。

综上所述，熊果酸对小鼠结肠组织有一定的毒性作用，但这种毒性作用并不显著，这可能是由于肠道系统大量摄入外源化学物质所致。停药后，肠道系统的这种变化可能会缓解。熊果酸对小鼠的肝脏和肾脏组织有较好的保护作用。将熊果酸制成保健品，或可延缓肝肾组织的衰老。但因熊果酸的吸收效果较差，将熊果酸制成生物利用度高，又不影响生物学功效的剂型是很有必要的，以期更好地为临床服务。