吕建雨 ， 张岳峰 ， 彭海馨 ， 王汇鑫 ， 李艳华

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江 哈尔滨 150030)

根据中医理论，黄芪性微温、味甘，有利水消肿、退肿生肌的功效，《名医别录》、《本草纲目》等中医学著作均认为其有补中益气的作用，药用历史悠久。黄芪在临床上对于治疗腹泻有着很好的疗效[1]，在生产养殖中，常常被加入到断奶猪日粮中使猪腹泻率显著降低[2]。生姜性温，是重要的药食同源药材，有祛风发汗、温中散寒的功效。黄芪搭配生姜对脾胃虚寒型腹泻有一定治疗作用。

腹泻作为猪群的一种常见症状，是指排便次数增多，明显超过平时频率，粪质稀薄，水分增加，伴有腹痛、排便急迫感、里重后急、失禁等症状。各个年龄段的猪均能患病，仔猪的发病率与死亡率最高，严重影响我国养猪业的快速发展，给我国养猪业带来了巨大损失。腹泻属中医“泄泻”范畴，脾虚是其发病的主要病机之一。传统中医理论认为，腹泻主要由于湿盛与脾胃功能失调所致。脾主运化、升清，胃主受纳、腐熟水谷。脾虚则升清运化失职，胃弱则受纳腐熟力衰，久及于肾，肾阳不足，则固摄失权，终导致肠道不固，清浊不分，而病泄泻[3]。治疗上以益气、健脾为主，有其他兼证则辨证用药[4]。黄芪有健脾益气的功效，生姜不仅可以健脾，还可抗菌、驱寒，两者配伍使用可补气健脾，温中散寒。由于传统中药复方具有多途径、多成分、多靶点的特点，通过现代医学很难阐明芪姜粉治疗脾胃虚寒型腹泻的作用机制。在系统生物学、多向药理学、计算生物学等多学科技术快速发展的基础上，从整体、系统角度研究药物机制的网络药理学是近10年提出的药物研发新方法，与中药复方基本特点相吻合[5]。本试验基于网络药理学的理论，运用网络药理学方法通过构建核心成分—靶点—通路网络，从整体、系统的角度上分析芪姜粉治疗猪脾胃虚寒型腹泻的效果和作用机制，为下一步的深入探究提供参考。

1 材料与方法

1.1 芪姜粉活性成分的筛选 利用中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)检索黄芪和生姜的有效成分，各单味药的活性成分口服利用度(OB)和类药性(DL)筛选阈值分别设置为OB≥30，DL≥0.18[6]。并收集对应靶点，将筛选出来的芪姜粉的活性成分信息在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)进行校正，检索条件设置为“Organism:Susscrofa”，获取活性成分和其对应的靶点。

1.2 芪姜粉—活性成分—靶点网络图的构建 整理从Uniprot数据库获取的活性成分和靶点，利用Cytoscape 3.7.2软件构建芪姜粉—活性成分—靶点网络图，分析活性成分和靶点之间的度(Degree)值。

1.3 芪姜粉—腹泻韦恩图的构建 以腹泻(Diarrhea)为关键词在GeneCards数据库与OMIM数据库中检索与腹泻相关的基因，通过Uniprot数据库进行校正，物种选择为猪(Susscrofa)，利用Venny 2.1.0在线作图工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)获得芪姜粉—腹泻共有靶点的韦恩图。

1.4 芪姜粉—成分—腹泻—靶点网络图的构建 整理交集靶点和对应的活性化合物，利用Cytoscape 3.7.2软件构建芪姜粉—活性成分—腹泻—靶点网络图。

1.5 蛋白质相互作用网络图的构建 将交集靶点上传至String数据库(https://string-db.org)，物种选择为猪(Susscrofa)，置信度高于0.7，并隐藏游离节点，导出蛋白相互作用(PPI)网络图及互作关系表。利用Cytoscape 3.7.2对互作关系表中蛋白连接关系进行分析，根据Degree值筛选核心基因并通过Excel绘制柱状图进行可视化。

1.6 基因本体(GO)功能富集注释分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 将交集基因上传至DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)数据库，设置物种(Species)为“Susscrofa(猪)”、背景(Background)为“Susscrofa”、标识符(Identifier)为“Official gene symbol (官方名称)”，进行 GO功能注释和KEGG富集分析。筛选P<0.05的富集条目，并根据P值降序排序，选择排名前20位的条目通过在线作图平台——微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行富集分析结果的可视化。

2 结果

2.1 芪姜粉—活性成分—靶点网络图的构建 在TCMSP分别输入芪姜粉中的2种药物：黄芪和生姜，一共可以得到352个活性成分。分别设置OB≥30，DL≥0.18，得到25个活性成分(黄芪20个，生姜5个)，剔除没有相关靶点的活性成分并通过Uniprot数据库校正，可筛选出20个活性成分(黄芪16个，生姜4个)，并对筛选出来的活性成分进行编号。各活性成分详细信息见表1。利用这20个活性成分和对应靶点的关系，通过Cytoscape 3.7.2软件构建“芪姜粉—活性成分—靶点”网络图，结果见图1。

表1 芪姜粉潜在活性成分Table 1 Potential active components of Qijiang powder

药物—活性成分—靶点网络图分析：图1中共包含181个节点和399条边，其中包括20个活性成分节点、159个靶基因节点和2个中药节点。利用“cytoHubba”插件对网络图进行拓扑分析，并根据“Degree(度)”值进行排序，Degree值越高代表活性成分或靶点在互作网络越重要，拓扑分析结果表明，排名前10位的活性成分分别为槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、7-O-甲基异丙醇胺(7-O-methylisomucronulatol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、刺芒柄花素(Formononetin)、豆甾醇(Stigmasterol)、异鼠李素(Isorhamnetin)、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚(3,9-di-O-methylnissolin)、美迪紫檀素[(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol]、毛蕊异黄酮(Calycosin)，各活性成分详细信息见表2。

表2 芪姜粉—活性成分—靶点网络中排名前10位的活性化合物信息Table 2 Information on the top 10 active components in the Qijiang powder—active components—target network

图1 芪姜粉—活性成分—靶点网络Fig.1 Drug—active components—target network of Qijiang powder蓝色菱形：靶基因； 紫色和黄色圆形：分别为黄芪、生姜的活性成分； 红色正六边形：黄芪； 绿色正六边形：生姜；节点大小与Degree值成正比Blue diamonds: Target genes; Purple and yellow circles: Active components of Astragalus membranaceus and ginger respectively; Red regular hexagon: Astragalus membranaceus; Green hexagonal:Ginger. The node size was proportional to the degree value

排名前10位的靶点分别为前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、核受体共激活因子2(NCOA2)、前列腺素内过氧化物合酶1(PTGS1)、钙调蛋白1(CALM1)、视网膜酸受体(RXRA)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、γ-氨基丁酸A受体α1(GABRA1)、Beta-2肾上腺素受体(ADRB2)和黄体酮受体(PGR)，具体结果见表3。

表3 芪姜粉—活性成分—靶点网络中排名前10位的靶点信息Table 3 Information on the top 10 targets in the Qijiang powder—active components—target network

2.2 芪姜粉化合物与疾病靶点交集Venn图的构建 从GeneCards数据库与OMIM数据库中共检索到5 403个腹泻相关靶点，将疾病靶点和药物成分靶点取交集，最终得到130个关键靶点。通过Venny 2.1.0在线作图工具绘制出芪姜粉—腹泻共有靶点的韦恩图，结果见图2。

图2 芪姜粉—腹泻共有靶点的韦恩图Fig.2 Venn diagram of mutual target of Qijiang powder—diarrhea

2.3 芪姜粉—活性成分—腹泻—靶点网络图的构建 利用Cytoscape 3.7.2软件构建芪姜粉—活性成分—腹泻—靶点网络图，结果如图3所示。在网络图中包括153个节点和470条边，其中腹泻节点1个、药物节点2个、活性成分节点20个以及靶蛋白节点130个。由图3可知，药物、活性成分、腹泻与关键靶点之间的关系错综复杂，1种有效成分可以作用于多个靶点，1个靶点也与多个有效成分相互作用，符合中药复方多途径、多成分、多靶点共同作用的基本特点，但是单以“Degree”值的大小去判断活性成分或靶点在治疗腹泻的生物进程中是否重要过于片面，需要继续深入探究。

图3 芪姜粉活性成分—腹泻—靶点网络图Fig.3 Active components—diarrhea—target network map of Qijiang powder蓝绿色圆形节点:猪腹泻相关靶点； 紫色菱形节点:化合物与猪腹泻共同靶点； 棕色和绿色正八边形节点:分别为黄芪、生姜的活性成分；节点大小与Degree值成正比Blue-green circular nodes:Porcine diarrhea related targets; Purple diamond node:Common target of compound and porcine diarrhea; Brown and green octagonal nodes:Active components of Astragalus membranaceus and ginger respectively. The node size was proportional to the degree value

2.4 芪姜粉在猪体内蛋白相互作用(PPI)网络图的构建 利用String数据库构建蛋白相互作用(PPI)网络图，物种选择为“Susscrofa”，打分值设置高于0.7最高置信度，PPI网络图见图4。将得到的数据进行整理排序，并将图中关键靶点度可视化，如图5。其中TNF、TP53、IL-8、IL-6等靶点排名靠前，推测可能在芪姜粉治疗猪腹泻的生物进程中发挥较重要的作用。

图4 芪姜粉—猪腹泻靶点PPI网络图Fig.4 PPI network diagram of Qijiang powder—porcine diarrheal targets

图5 芪姜粉抗腹泻核心靶点柱状图Fig.5 Anti-diarrhea targets centered networks of Qijiang powder

2.5 芪姜粉治疗猪腹泻GO功能富集注释分析及KEGG通路富集分析 将芪姜粉—猪腹泻PPI网络图中的靶点基因上传于DAVID数据库，物种选择为“Susscrofa”，将得到的数据进行筛选后(P<0.05)，共得到GO注释分析条目272个，其中生物过程(Biological process)条目198个、分子功能(Molecular function)条目23个、细胞组成(Cellular component)条目51个，将所得GO注释分析条目根据P值进行降序排序，分别取各组前10位绘制柱状图。由图6可知，生物过程主要涉及RNA聚合酶II启动子转录的正调控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、脂多糖介导的信号通路(Lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)和腺酸酯环酶激活肾上腺素受体信号通路(Adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway)过程比较靠前；分子功能主要涉及细胞外间隙(Extracellular space)、细胞核(Nuclear)、细胞外基质(Extracellular matrix)等；细胞组成主要涉及序列特异性DNA绑定转录因子(Transcription factor activity,sequence-specific DNA binding)、相同的蛋白质结合(Identical protein binding)、细胞因子活性(Cytokine activity)等。

图6 芪姜粉—猪腹泻GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of Qijiang powder—porcine diarrhea

对KEGG通路进行筛选(P<0.05)，可得到119条通路，按降序排列，将前20条通路可视化为气泡图，结果见图7。图中气泡的大小代表该通路富集到的靶点数量，气泡颜色的深浅代表蛋白富集程度的高低。由图7可知，主要富集条目包括癌症中通路(Pathways in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、美洲锥虫病[Chagas disease(American trypanosomiasis)]等。

图7 芪姜粉—猪腹泻KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathology enrichment analysis of Qijiang powder—porcine diarrhea

3 讨论

传统中医理论认为，腹泻隶属于“泄泻”范畴，疾病日久不愈，加之失治误治，患者常表现为脾胃虚寒证[7]。脾胃虚寒型是一种中医证型，主要是指脾胃阳气虚衰，阴寒内盛所表现的证候，常有纳呆腹胀、脘腹痛、四肢不温、大便稀溏、小便清长或不利等症状表现[8]。现代医学理论认为，腹泻的发病机制常常涉及炎症、水和电解质失衡、胃肠激素分泌、肠黏膜损伤等因素[9]。此外，多种肿瘤也可诱发腹泻，腹泻是肿瘤的一种常见临床症状，肿瘤相关性腹泻多为伴随症状，但也有以腹泻为首发或突出表现[10]。

网络药理学是系统生物学的重要组成部分，其整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医药学的基本特点相吻合。网络药理学提供了一种新型的研究方法，通过大数据的分析，将传统中药研究和现代药理学联系在一起，多方面、深层次、系统性的挖掘药物与机体之间的关系，得到越来越多学者的认可，显著加快中药现代化、国际化的进程[11]。本试验主要通过对芪姜粉—活性成分—靶点网络、芪姜粉—活性成分—腹泻—靶点网络图中拓扑学参数的计算和蛋白相互作用(PPI)网络图等进一步揭示关键作用靶点、药效物质基础通路、活性成分和通路。

通过网络药理学分析预测芪姜粉中发挥抗腹泻作用的药效物质基础可能是槲皮素、山奈酚、7-O-甲基异丙醇胺、β-谷甾醇等。槲皮素可以通过抑制小鼠小肠推进，减慢小肠蠕动作用，来对腹泻产生抑制作用[12]。山奈酚作为一种常见的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤的作用[13]。廖美华等[14]发现，山奈酚是参苓白术散治疗腹泻型肠易激综合征(IBS-D)的最核心化合物之一，在干预IBS-D过程中起到重要的调控作用。根据现有文献，未检索到7-O-甲基异丙醇胺的有关报道，其药理作用有待进一步研究。β-谷甾醇具有抗肿瘤[15]、抗炎[16]和降低胃黏膜损伤[17]的作用。研究表明，β-谷甾醇对于枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等胃肠道常见菌群均有较好的抑制作用[18]。冯思敏等[19]发现，β-谷甾醇通过抑制IL-6和COX-2的表达来改善葡聚糖酸钠诱导的小鼠结肠炎，抑制腹泻、体重下降、便血、结肠缩短、结肠组织形态破坏等典型的急性肠炎病症。综上可知，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇可能通过抑制炎症发生、调节细胞凋亡来治疗腹泻。研究发现，3种活性成分均有保护、修复损伤细胞的功能[20-22]，对治疗腹泻也有一定的帮助。

通过对活性成分—靶点网络图进行分析，其中可能发挥关键作用的靶点有前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、核受体共激活因子2(NCOA2)、前列腺素内过氧化物合酶1(PTGS1)、钙调蛋白1(CALM1)等。PTGS1和PTGS2是PTGS的2种同工酶，其中PTGS1为结构型，主要参与调节正常组织细胞的多种生理活动[23]；PTGS2为诱导型，通常介导炎症反应[24]以及调控肿瘤的生成和发育[25-28]。临床试验表明，PTGS2可以通过调节凋亡抑制基因(Bcl-2)的表达[25]，对肿瘤产生抑制作用，PTGS2抑制剂也将成为抗肿瘤治疗的新方法。NCOA2在生物体内涉及发育、内分泌调节和肿瘤发生等反应[27]，NCOA2是乳腺癌治疗的潜在靶点，使MAPK/ERK信号级联的管制下降，调控NCOA2的下游目标RASEF，显著抑制不同乳腺癌细胞系的细胞增殖。CALM是细胞内Ca2+的主要受体，参与细胞生长和代谢，在细胞分裂增殖和肿瘤的侵袭、转移中起重要作用[28]。CALM1与骨关节炎的发生也有一定的联系[29]。综合上述可知，这些靶点的功能多集中于炎症及细胞凋亡方面，正好切入腹泻的发病机制，其相关联的蛋白以及信号通路调节则需要进一步分析。

通过对蛋白相互作用(PPI)网络图进行分析，共筛选出核心靶点20个，其中肿瘤坏死因子(TNF)、细胞肿瘤抗原基因(TP53)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)相关性较高，推测可能在治疗猪腹泻中发挥较重要的作用。TNF是一种常见的促炎因子，可诱发炎症因子的释放，加重机体的炎症反应[30]，并且对肿瘤具有直接杀伤或抑制增殖的作用[31]。TP53 是一种广谱肿瘤抑制基因，其产物为多功能的转录调节因子，可以发挥调节细胞生长、细胞凋亡和 DNA 修复的作用[32]。IL-6是由单核-巨噬细胞等分泌的促炎性细胞因子，对调节组织损伤、免疫反应和肿瘤生长、转移方面有重要意义[33]。IL-6可以通过损坏肠黏膜屏障功能，使炎性渗出增加，从而引起腹泻[34]。临床试验表明，通过降低炎症因子TNF-α和IL-6 的水平，可以减轻大肠埃希菌感染的哺乳期小型猪的腹泻程度[35]。IL-8是一种强而有力的中性粒细胞趋化因子和活化因子，在炎症反应中起更直接的介导作用。张珺等[36]认为，血清中IL-8、TNF-α水平可作为反映溃疡性结肠炎病变程度和判断预后的一个客观指标。有研究表明，IL-8可通过肿瘤及肿瘤血管内皮细胞表面的受体，直接或间接促进肿瘤细胞的增生、新生血管的形成，从而促进肿瘤的生长和转移[37]。由此推测，芪姜粉治疗腹泻可能是通过TNF、TP53、IL-6和IL-8等关键靶点抑制机体的炎症反应及调控细胞凋亡来发挥作用。

由KEGG信号通路的富集分析气泡图可知，涉及与癌症相关的通路较多，因此推测槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等活性成分与癌症的发生有很大关系，与药物活性成分联系较密切的关键靶点，例如PTGS2、NCOA2、PTGS1、CALM1等，均涉及生物体内癌症的发生发展与细胞凋亡的调控。由此推测，芪姜粉可能通过PTGS2、NCOA2、PTGS1、CALM1等靶点发挥抗癌作用。

综上所述，芪姜粉以槲皮素、山奈酚、7-O-甲基异丙醇胺、β-谷甾醇等药效物质基础调控PTGS2、NCOA2、PTGS1、CALM1等癌症通路的多个靶点，通过抗炎、调控细胞凋亡和保护损伤细胞的机制，发挥抗腹泻的作用，体现了中药多成分、多靶点和整体发挥作用的特点，为进一步深入揭示芪姜粉治疗腹泻的药理机制提供了科学依据。但是预测结果可能与实际存在偏差，需要进行体外试验深入探究，阐明其具体作用机制。