刘 倩，王少婷，姜永玮，于 洋，丛 笑，曹永彤，马 亮

（中日友好医院 检验科，北京 100029）

随着医学科学技术的发展，临床分子生物学诊断水平在不断提升，临床分子生物学检测从手工操作发展为更精准的自动化操作，可排除人为因素造成的误差及污染。 根据临床实验室标准研究所（clinical and laboratory standards institute，CLSI）[1，2]以及中国合格评定国家认可委员会（China national accreditation service for conformity assessment，CNAS）[3～5]的要求，在新引入仪器进行常规应用前，由临床实验室对仪器设备及项目进行独立验证。现将全自动核酸提取仪Autrax-192 自动提取高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）核酸的正确度、精密度、线性范围、分析灵敏度及携带污染结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

上海之江生物科技有限公司可溯源HPV（16+）型企业参考品 L1 （1.0E7copies/ml）、L2 （1.0E6copies/ml）、L3（1.0E5copies/ml）、L4 （1.0E4copies/ml）、L5（2.5E3copies/ml）、L6（6.25E2copies/ml）。 HR-HPV 15 种分型核酸（16、56、31、18、52、58、68、45、82、33、35、39、51、59、66）阳性质控品P4（1.0E4copies/ml）、P5（1.0E3copies/ml）、P6（1.0E2copies/ml）。

1.2 仪器与试剂

全自动核酸提取仪Autrax-192，SLAN-96 PCR 仪，5810R 台式高速冷冻离心机，HR-HPV 核酸15 种分型（16、56、31、18、52、58、68、45、82、33、35、39、51、59、66） 测定试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司）。

1.3 性能评价方案

1.3.1 正确度评价

选取40 份中日友好医院HR-HPV 检测样本，采用实验室已通过室间质评的手工法提取核酸作金标准，同步使用Autrax-192 提取核酸进行平行实验，SLAN-96 PCR 仪进行扩增反应。 记录检测结果，进行正确度评价。

1.3.2 精密度评价

参考品L1 和L3， 使用Autrax-192 同日进行20 次核酸提取，进行荧光PCR，得出批内均值、标准差、变异系数CV 值；参考品L1 和L3 分装为20 份置于-20℃保存，使用Autrax-192 连续提取核酸20d，进行荧光PCR，得出批内以及批间均值、标准差、变异系数CV 值。

1.3.3 线性范围评价

参考品L1- L6， 使用Autrax-192 每个浓度进行6 次重复实验，计算L1- L6 每个浓度均值Ct 值，将测得值与理论值进行线性回归分析，评估其线性区间。

1.3.4 分析灵敏度探索

在准确度、精密度结果达到实验室要求后，阳性质控品P4、P5、P6 使用Autrax-192 提取核酸进行分析灵敏度探索，每个浓度5 次重复实验，记录检出率。

1.3.5 携带污染评价

使用Autrax-192 进行线性范围评价，同时将阴性样本穿插置于样本孔位，每次放置3 例阴性样本，提取核酸进行荧光PCR，评估Autrax-192 防污染能力。

1.4 病毒核酸提取

根据Autrax-192 操作说明书，自动化核酸提取、试剂分装及模板加样，模板DNA 4滋l，聚合酶链反应检测混合液36滋l。 同时使用传统手工煮沸法对40 例临床样本进行核酸提取，模板DNA 4滋l，聚合酶链反应检测混合液36滋l。

1.5 HR-HPV DNA 分型检测

采用HR-HPV 15 种型别的特异性引物以及荧光探针，应用聚合酶链式反应（PCR）结合Taqman 技术，对特异性DNA 核酸片段进行分型定性检测， 共包含4 种反应体系，1 为16 型、56 型、31 型以及内标（internal control），2 为18、52、58、68，3 为45、82、33、35，4 为39、51、59、66。

SLAN-96 PCR 仪， 设置循环参数为94℃10min；93℃10s→62℃31s，循环40 次，单点荧光检测在62℃，荧光通道选择FAM 和VIC 通道。

1.6 结果判读

4 种混合液在FAM 和VIC 通道均无Ct 值， 判定为阴性；Ct 值≤38.0 且扩增曲线呈典型的S 型，判定为HPV 阳性；Ct 在38.0～40.0 之间，需重复测定，若仍在38.0～40.0 之间且扩增曲线呈典型S 型，则判定为阳性，反之为阴性。

1.7 统计学方法

应用SPSS22.0 进行数据处理及分析。

2 结果

2.1 正确度

以通过室间质评的手工法为金标准，HR-HPV 临床样本40 例，其中阳性35 例、阴性5 例； Autrax-192 提取核酸检测结果阳性35 例，阴性5 例，与手工法阴阳符合率为100%，符合实验室要求，见表1。

表1 全自动核酸提取仪Autrax-192 与手工法比较

2.2 精密度

选取高浓度L1 和低浓度L3 进行精密度实验，同日进行20 次核酸提取进行荧光PCR，得出Ct 值。 批内变异系数2.96%～3.36%；参考品分装为20 份-20℃保存，连续测定20d，得出批间变异系数CV 为2.89%～3.41%，见表2。

表2 批内以及批间精密度

2.3 线性范围

L1～L4 进行6 个复孔检测，L5 及L6 进行5 个复孔检测，记录每孔位CT 值。 各孔位CT 值的CV 值均5%，其中L6 浓度水平未检出。

以L1～L5 样本理论浓度对数值为X，各浓度实际测定值均值为Y，进行线性拟合。 在2.5E3～1.0E7copies/ml 范围内，Y=-3.9097X+46.336，线性相关系数R2=0.991，线性优，本系统对于高危型HPV 病毒核酸检测性能优于厂家声明1.0E4～1.0E7copies/ml。

2.4 分析灵敏度试验

在精密度、正确度试验结果达到实验室要求后，使用阳性质控品P4、P5、P6 对HPV 15 种型别进行检测。 18、33、35、39、45、51、52、58、59、66、68、82 型分析灵敏度可达1.0E3copies/ml，优于生产厂家声明1.0E4copies/ml；16 型、31型、56 型分析灵敏度达到生产厂家声明。

2.5 携带污染

共检测阴性样本18 例，结果均为No Ct，携带污染率为0。

3 讨论

HR-HPV 持续反复感染与子宫颈癌[6]及其癌前病变密切相关，2014年WHO 及2015年美国FDA 提出用HPV分型检测[7]作为宫颈癌筛查的首选方法，各医院对于HRHPV 核酸检测的质量以及效率要求越来越高。 因此选择更为客观且标准化，不易受人为因素干扰的全自动核酸提取仪， 对于提升核酸提取及检测的效率及质量尤为重要。因此，本研究在正确度、精密度、线性范围、分析灵敏度、携带污染[8，9]对Autrax-192 进行了评价。

精确度，又称准确度，指测得值与“真值”的接近程度以及测得值之间的一致程度。本次正确度实验以通过室间质评的手工法为金标准， 同步Autrax-192 进行核酸检测，结果与手工法阴阳符合率符合实验室要求； 精密度评价，选两个水平参考品进行多次重复实验，批内精密度和总精密度均达到ISO15189 要求， Autrax-192 具有良好的精密度以及重复性。

线性范围是反映实验室方法性能的重要指标，在2.5E3～1.0E7copies/ml 浓度内，线性回归相关系数R2>0.99，说明仪器对于高危型HPV 病毒核酸检测性能良好， 并且优于厂家声明的线性浓度范围（1.0E4～1.0E7copies/ml）。

分析灵敏度评价中，高危型HPV-16、56、31 型分析灵敏度达到厂家声明1.0E4copies/ml， 其余亚型可达1.0E3copies/ml。 本试剂盒使用的是聚合酶链式反应（PCR）结合Taqman 技术， 引入内标 （internal control） 作为荧光PCR 反应的内参，排除掉管间差异及避免假阴性结果。 学者[10]发现内标在一定程度上会导致PCR 检测灵敏度下降，尤其当两种模板的起始拷贝数相差较大时，竞争会表现得更为显著。 本研究中，高危型HPV-16、56、31 型与内标在同一反应体系中，分析灵敏度虽然达到了厂家声明，但与其余3 个体系相比，分析灵敏度下降，说明内标与靶模板存在竞争抑制，待测模板的扩增受一定干扰。 为保证低浓度待测模板的检出， 对于内标基因的浓度还需后续探索。实验过程中未发现仪器存在携带污染。

综上所述，Autrax-192 可以满足临床工作需要， 全程自动化提取及加样过程标准化操作，减少了不同人员之间的差异，在保证了检测结果准确性的前提下，提升了检测效率，实验室可以用于常规HR-HPV 核酸检测。