焦 健，张理茜

（中国科学院科技战略咨询研究院，北京 100190）

目前，越来越多的小分子RNA，如miRNA 或siRNA 等，通过测序或生物信息学预测的手段被报道，而其中仅有少数研究较多。表达和沉默小分子RNA 是广泛使用的反向遗传学策略[1]，为了研究小分子RNA 在植物病原菌与其寄主互作中的生物学功能，尤其是与麦类作物寄主互作机制，本文研究了基于VIGS 的小分子RNA 沉默技术体系。

大麦条纹花叶病毒（Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV）载体应用于单子叶麦类作物的研究，最早于2002 年由Holzberg 等[2]报道。研究通过改造BSMV病毒载体，如删除BSMV的外壳蛋白等，以PDS 基因作为试验对象，系统研究了BSMV-β 或BSMV-γ链插入片段的位点、方向和同源性等，详细阐明了BSMV 病毒载体在麦类作物中可作为反向遗传学研究工具的可行性。该研究首次在单子叶麦类作物中证明了应用BSMV 病毒载体的有效性，为麦类作物基因功能的验证和单子叶植物RNA 沉默机制的研究提供了有效工具。本研究利用BSMV 作为载体，开展麦类作物及其病原真菌的小分子RNA 沉默技术体系研究，旨在为麦类作物及其病原真菌的相互作用提供一种反向遗传学的技术策略。

1 材料与方法

1.1 植株材料

小麦材料：小偃54；其他植株材料：本生烟、拟南芥等。

1.2 载体和菌株

VIGS 相关的病毒载体：BSMV-LIC 载体（α，β 和γ 均为DNA 质粒）。

表达载体：pGreen 载体，用于内源siRNA 或miRNA 在本生烟中高表达。

克隆载体：pEASY-T、Gateway 相关载体。

大肠杆菌菌株：DH5α 和DH10B；农杆菌菌株：GV3101和EHA105。

1.3 BSMV pCaBS-γ-LIC 载体的构建

用于内源基因沉默：PCR 扩增目的片段时，最优片段大小约为200～400 bp。正向引物5’端需加LIC 接头的序列为5’-AAGGAAGTTTAA-3’，反向引物5’端需加LIC 接头的序列为5’-AACCACCACCACCGT-3’。

操作流程：PCR 扩增带有LIC 接头的目的片断；将pCaBS-γ-LIC 载体用ApaI 完全酶切，并依照图1 流程将目的片段与载体用LIC 克隆方法连接。

图1 BSMV pCaBS-γ-LIC 载体的构建示意图

2 结果与分析

2.1 构建BSMV pCaBS-γ-LIC 沉默载体

首先构建了用于沉默目标小分子RNA 基因的载体，将BSMV 载体与AtIPS1 序列相连接，详见图2，表达这些小分子RNA 靶标模拟序列，已达到沉默小分子RNA 的目的。

图2 BSMV-γb 载体及基于AtIPS1 的MIM 序列示意图

构建过程。在BSMV pCaBS-γ-LIC 载体的LIC 端插入MIM 序列，即基于AtIPS1 序列改造的基本骨架序列，而且图中虚线所示片段被替换为目标小分子RNA 的同源片段，所有片段都采用高保真碱基人工合成方法。

2.2 沉默技术体系的效果验证

利用构建的BSMV-MIM 载体，有效沉默了小麦miR159a。BSMV 表达MIM159a 序列可以通过半定量RT PCR 检测到，BSMV 侵染小麦叶片也出现了明显的病毒症状。通过qPCR 检测小麦miR159a 及其靶标基因TaMYB3，发现小麦miR159a 转录水平相对表达量显著下降，而靶标基因TaMYB3 的转录水平相对表达量显著升高。结果说明，BSMV 表达MIM159a 序列可有效沉默miR159a。

3 结论与讨论

在植物中，少数带注释的miRNA 基因家族在植物家族之间是保守的，而大多数是家族或物种特异性的[3]。许多经典miRNA 是保守的，一些调节保守的目标在植物界中显示出保守的功能。小麦特异性miRNAs 在小麦生长和发育中可能以物种特异性方式发挥作用。miR159 在单子叶植物和双子叶植物中是保守的，是小麦叶片中具有较高表达水平的几个miRNA 之一。

miRNA 的过表达和沉默是研究miRNA 功能的两种最广泛使用的反向遗传策略。研究miRNA 功能的传统方法通常需要繁琐且耗时的工作，才能生成稳定的转基因植物。

基于BSMV 的miRNA 沉默系统具有优于其他植物miRNA功能分析的几个优势。首先，基于BSMV 的miRNA 沉默系统高效快速，4 周内即可观察到miRNA 沉默介导的表型。其次，基于BSMV 的miRNA 沉默系统不需要复杂的小麦稳定转化程序，只需要简单的农杆菌渗透技术即可进行miRNA 沉默。这对于miRNA的功能表征特别有效，这些miRNA 的敲除可能导致转基因品系中的孢子体或配子体致死，以及不适用于稳定遗传转化的小麦作物。此外，除了自然寄主大麦和小麦外，BSMV 的寄主范围很广。

本次研究证明了改良的BSMV 介导的小分子RNA 沉默系统可用于抑制普通小麦中的内源miRNA 活性，成功沉默了小麦中的miR159a。通过PCR 或小分子RNA Stem-loop Real-Time PCR 技术，检测到相应的MIM 序列，并且在表达MIM 序列的小麦植物中，miR159a 靶基因的水平显著增加，但在BSMVEV 感染的植物中没有检测到。结果表明，基于BSMV 的小分子RNA 沉默系统通过过表达小分子RNA 的目标模拟物，可有效沉默小麦中的内源性小分子RNA。