韦洪才， 韦启行， 王显晋

(贵州省望谟县农业农村局，贵州望谟552300)

1 项目基本情况

项目名称：望谟县兽医实验室仪器设备及检测试剂采购项目。资金来源：县级财政解决资金40万元。建设内容：采购核酸自动提取仪1台、荧光定量PCR仪1台、冷冻离心机1台、组织破碎仪(匀浆仪)1台、金属恒温仪1台、非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒15盒、抗凝真空采血管5 000支、样品冻存管2 000支、移液器4支、八联PCR反应管1万个、一次性兽用采血器1万支等。

2 实验室改造前状态

2.1 基本情况望谟县兽医实验室现有检测人员5人，其中本科学历3人，大专学历2人，全部为畜牧兽医相关专业。主要检测能力为猪瘟、口蹄疫、小反刍兽疫、高致病性禽流感、猪蓝耳病、鸡新城疫、布鲁氏菌病等疫病抗体检测。

2.2 主要仪器设备生物安全柜1台、100 L高压蒸汽灭菌器1台、普通离心机2台、纯水仪1台、超声波清洗仪1台、恒温干燥箱1台、紫外灯消毒车1台、超净工作台1台、恒温水浴锅1台、0.1～10 μL单道移液器5支、10～100 μL单道移液器5支、100～1 000 μL 单道移液器5支、1 000～5 000 μL单道移液器2支。

3 改造过程

3.1 改造背景2018年8月，国家农业农村部公布非洲猪瘟首次在我国确诊，2019年在我国多地暴发流行，造成大量生猪死亡。根据《农业农村部关于加强屠宰环节非洲猪瘟检测工作的通知》(农牧发〔2019〕7号)关于“要加强县级动物疫病预防控制机构非洲猪瘟实验室检测能力建设”的要求，为了提升望谟县兽医实验室的检测能力，望谟县农业农村局于2019年向县人民政府申请实验室改造资金40万元。

3.2 主要新增设备见表1。

表1 实验室主要新增设备

3.3 主要新增试剂及耗材非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒、核酸提取试剂盒、抗凝真空采血管(抗凝剂：EDTA-K2)、200 μL八联荧光PCR反应管、带过滤棉吸头(10、200、1 000 μL)等。

3.4 实验室分区改造按照非洲猪瘟的检测流程及实验室功能分区改造原有的病原学检测室和精密仪器室。按功能分为4个区：样品处理区、核酸提取区、试剂准备区、核酸扩增区。每区有明显的标识，工作严格区分，操作器材专用，遵循检测流程方向[1]。样品处理区放置的主要设备是生物安全柜、组织研磨仪、普通离心机、冷冻离心机、恒温水浴锅、金属恒温仪等，主要功能是样品灭活、离心、混样及加样到核酸提取管(板)等，为下一步核酸提取做准备；核酸提取区放置的主要设备是核酸提取仪，主要功能是提取病原核酸；试剂准备区放置的主要设备是超净工作台，主要功能是将检测试剂分装到PCR反应管、核酸加样等；核酸扩增区放置的主要设备是荧光定量PCR仪，主要功能是进行PCR扩增、读数及打印实验结果等。各区之间相对独立，移液器必须分区固定使用，避免混用[2]。

3.5 加强生物安全管理一是进一步完善生物安全手册，让所有检测人员熟知；二是完善生物安全制度并上墙；三是强化人员培训，特别是菌(毒)种保存、样品转移、人员防护、实验室“三废”处理等方面的培训；四是强化实验室危险化学品管理，必须使用耐酸碱的专用试剂柜保存，双人双锁管理；五是实验室固体废物由第三方具有医疗废物处置资质的公司回收处理，禁止简单焚烧处理。

3.6 检测技能培训新设备安装后，由荧光定量PCR仪生产厂家派技术人员调试设备，并对我县检测人员进行非洲猪瘟病毒核酸检测的技术培训，我县再派2名检测人员到黔西南自治州农业农村局学习非洲猪瘟病毒核酸检测技术1周，经州农业农村局培训并考核合格后，再回来培训其他检测人员，所有检测人员经考核合格后再上岗。

3.7 省级验收考核2019年我县兽医实验室经改造后，向贵州省农业农村厅申请非洲猪瘟检测资质认定，经盲样比对考核合格后，实验室获得非洲猪瘟病毒核酸检测资质。

4 检测能力提升

改造后实验室不仅具备常规常见疫病的血清学检测能力，新增了非洲猪瘟病毒核酸检测能力。已完成9 500份非洲猪瘟病毒检测任务，每次检测对照组试验均成立，准确率100%，未出现实验室污染、试剂污染情况，共出具非洲猪瘟病毒检测报告近100份。

5 实验室改造经验与建议

5.1 实验室必须严格分区样品处理区、核酸提取区、试剂准备区、核酸扩增区必须严格分区，每区有明显的标识，空间相对独立，工作严格区分，操作器材专用，严格按流程操作。这样才能尽量减少实验区的核酸污染风险。

5.2 核酸提取仪与PCR仪检测通量要匹配我县核酸提取仪为32个通量，荧光定量PCR仪为48个通量，当需要检测的样品数超过32个时，1次核酸提取无法让荧光定量PCR仪48个通量满荷运转。建议在购买核酸提取仪时，要确保核酸提取仪的检测通量≥荧光定量PCR仪的通量，才能使二者充分发挥作用。

5.3 PCR仪配置选择建议生猪养殖量较大的县配置96个通量的荧光定量PCR仪，养殖量较少的县可以配置48个通量的荧光定量PCR仪。

5.4 医疗废物的处置实验室的所有固体医疗废物必须在实验结束后放入高压锅内灭活处理，然后由第三方具有医疗废物处置资质的公司回收处理，未经灭活处理的医疗废物不可流出实验室；液体废物经集中消毒无害化处理后再排入污水管道。

5.5 严格消毒措施每次试验结束后，试验台面用三氯异氰尿酸粉(有效氯含量30%)按1∶250稀释后擦拭消毒；实验室地面用三氯异氰尿酸粉按 1∶250稀释后拖地消毒；生物安全柜、超净工作台等金属台面可以用75%酒精棉球擦拭消毒(金属部件使用含氯消毒剂容易锈蚀，应慎用)；各区在实验前、后应分别开启紫外灯消毒30 min。严格消毒措施是消除实验室病毒污染、核酸污染最有效的手段之一。

5.6 重视检测人员培养设备、试剂、人员三者是决定非洲猪瘟病毒检测试验是否精准的重要因素，每个检测员都要经过检测技术、生物安全、质量管理体系等培训并考核合格后再上岗。检测人员每年培训不少于1次，适时学习和掌握新知识、新技术、新方法。

5.7 通风系统走向设置要科学由于PCR实验室在加样操作过程中可能产生气溶胶，为避免气溶胶扩散出去对外界造成污染，同时为了避免各房间之间通过风管系统造成交叉污染(如：中央空调可使实验室各区域气流互通，造成整个实验室污染)，建议实验室最好采用全新通风系统，在各区域独立安装分体式空调或者安装PCR实验室专用的分区通风系统。此外要注意实验室内的空气在不同区域的流向问题，防止扩增产物随气流进入上游扩增前的“洁净”区域。简易的实验室可以安装不同数量的排风扇实现不同区域的压差[3]。