葛生虎，齐晓亮，张 智

（1.河北铭诸生物科技有限公司，河北 邢台 054000；2.邢台市农业农村局动物疫病预防控制中心，河北 邢台 054000）

猪伪狂犬病（Pseudorabies, PR）在我国猪场相对较为常见，该病由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）感染而引起，猪群感染该病后可出现发热、神经症状、腹泻及繁殖障碍等临床症状，且不同发育阶段猪群临床症状差异较大[1]。尽管PRV的自然宿主是猪，但该病原可感染多种哺乳动物，其中包括犬科动物（犬、狐狸、貉和狼等）、反刍动物（牛、羊等）和啮齿动物（鼠）等，因此该病的广泛流行给相关经济动物养殖业（如牛、羊和狐狸等）健康发展造成巨大的威胁[2]。此外，已有研究表明，PRV可能具有感染人的能力，Liu等首次从病人脑脊液中成功分离PRV变异株，提示PRV具有向人群的跨物种传播能力，这无疑对养猪工作人员和消费者健康造成潜在威胁[3]。

得益于PRV基因缺失疫苗和相应检测技术的广泛应用，我国猪场PRV流行情况得到较好的控制，但当前广泛使用的Bartha-K61疫苗对PRV变异株防控能力有限，导致我国猪场PR防控压力较大，甚至部分猪场仍然流行PRV野毒。为初步调查河北省部分地区PRV野毒流行情况及毒株基因型，笔者于2021年3—10月从河南部分地区共收集114份疑似感染PR病猪组织样品，通过分子生物学技术确定以上样品PRV野毒感染率，同时对部分样品gE基因序列进行扩增与分析，初步确定流行毒株的遗传变异情况及基因型，旨在为该地区PR的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2021年3—10月从河北邢台及周边地区收集疑似感染PR病猪组织样品（淋巴结、扁桃体和脑等组织）114份，病猪临床症状主要包括仔猪腹泻、神经症状等，繁殖母猪流产及死胎等。所有猪场均对猪群免疫接种过PRV gE基因缺失弱毒/灭活疫苗。

1.2 临床病料处理及检测

采用灭菌眼科剪和手术刀剪取约0.5 g组织样品，加入少量灭菌PBS溶液后研磨匀浆，冻融3次后以12 000 r/min离心5 min，取200 µL上清液用于DNA/RNA基因组提取，基因组提取步骤严格按照试剂盒说明进行。采用商业化PRV-gE real-time PCR检测试剂盒对样品中目的基因进行检测，若样品CT值低于35则判定为PRV野毒阳性，CT值高于35则判定为阴性。

1.3 PCR扩增PRV-gE基因序列

选择3份PRV阳性样品（CT值＜25）用于后续试验，以PCR法对gE基因全长序列进行扩增，其扩增引物序列见参考文献[4]。PCR扩增体系（25 µL）包括2×PCR预混液12.5 µL，上、下游引物各0.5 µL，模板3.0 µL及灭菌蒸馏水8.5 µL；反应条件为98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35个循环；72 ℃ 7 min。反应结束后取5.0 µL产物用于琼脂糖凝胶电泳，其后取剩余PCR产物送至测序公司进行双向测序。

1.4 序列分析

委托公司对返回序列进行拼接后，在基因库内下载具有代表性不同基因型PRV毒株gE基因序列。以DNAStar软件对本文获得毒株及参考毒株序列进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析；以MEGA 7.0软件构建遗传进化树，分析本文获得序列遗传变异情况。

2 结果

2.1 河北部分地区伪狂犬病病毒感染情况调查结果

本次调查共检测送检样品34批次，其中10个批次样品猪存在PRV野毒阳性样品，批次阳性率为29.41%；114份送检样品中有16份样品检测为PRV野毒阳性，平均阳性率为14.04%（16/114）。按照不同地区来源样品进行统计，发现邢台市、衡水市、石家庄市、邯郸市和其它地区样品PRV野毒检出率为6.25%～22.73%，其中石家庄市检出率最高，为22.73%（表1）。

表1 河北部分地区伪狂犬病病毒感染情况调查结果

2.2 不同季节及临床症状样品伪狂犬病病毒检测情况

将送检样品按照时间和病猪临床症状进行分类统计，结果如表2所示，不同季节送检样品PRV野毒阳性率为12.20%～16.67%，其中以秋季送检样品阳性率更高（16.67%），而春季和夏季阳性率差异较小，分别为12.20%和13.51%。PRV感染可导致猪群出现腹泻、神经症状和流产等症状，进一步分类统计发现表现腹泻、神经症状和流产或死胎样品PRV野毒检出率分别为14.29%、15.38%和8.33%。

表2 不同季节及临床症状样品伪狂犬病病毒检测情况

2.3 部分PRV毒株基因型及遗传变异情况分析

为初步分析河北省部分地区PRV流行毒株基因型及遗传变异情况，采用PCR法对3份病毒载量较高（CT值＜25）样品PRV-gE基因全长序列进行扩增、测序及分析。结果发现3份样品gE基因序列大小均为1 740 bp，其核苷酸和对应氨基酸序列与国内2012年后流行PRV变异株对应序列同源性分别为99.4%～100.0%和99.7%～100.0%；与国内2012年前流行PRV传统株对应序列同源性分别为98.9%～99.1%和98.4%～98.8%；与国外流行PRV毒株对应序列同源性分别为97.4%～98.6%和95.6%～97.5%。进一步系统进化树分析结果表明，本试验获得的3个样品对应毒株与国内流行变异株位于同一分支，但与国内流行PRV经典株和国外流行毒株所属分支则相距较远。以上结果表明，本次研究分析的3个PRV流行毒株均属于变异株，且序列变异程度相对较低。

3 讨论

根据基因序列差异，可将当前国内外流行PRV毒株分为PRV变异株（国内2012年后流行株）、传统株（国内2012年前流行株）和国外流行株[2]，而目前存在部分免疫接种Bartha-K61疫苗的猪场仍然暴发PR疫情（由PRV变异株感染引起），这说明当前使用的疫苗对变异株保护力较差[5]。为了解当前河北省PRV流行及基因变异情况，本研究于2021年对河北邢台及周边地区PR疑似病料进行PRV-gE核酸检测，并对部分样品gE基因序列进行扩增、测序与分析。结果发现收集的114份疑似感染PR样品中PRV野毒阳性率为14.04%，且各地区均检测到PRV阳性样品，说明PRV野毒在河北省广泛流行。

由于目前猪场环境（温度和湿度）相对恒定，且猪场持续对猪群免疫接种疫苗防控PR，使得不同季节PRV检出率差异较小，而本研究中秋季来源样品较夏季和春季样品PRV检出率稍高，这可能与送检样品数量和样品来源病猪临床表现差异等有关。进一步分析结果发现，表现腹泻、神经症状和流产或死胎样品PRV野毒检出率分别为14.29%、15.38%和8.33%，值得注意的是此类临床症状均与PR相关，但PRV检出率依然相对较低，说明送检样品可能存在其它病原感染，如猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型和猪流行性腹泻病毒等。提示对送检病料应进行多种病原检测，以免造成误诊或漏诊；或依靠传统的临床诊断已无法满足当前疾病诊断。

进一步对3份PRV阳性样品gE序列扩增与分析结果表明，3个毒株均属于PRV变异株，由于当前使用的Bartha-K61缺失疫苗无法对PRV变异株感染提供完全防控，提示研究人员需诊断当前流行PRV变异株研发更加有效的疫苗，或制定相应的净化策略，以期尽快净化PR，减少该病对养猪业的危害。