吴滔 陈楚涛 杨莉娟 邹耀威 马剑达 徐延卉 贾磊 戴冽

【摘要】目的 探討血清学自身抗体阴性类风湿关节炎（RA）患者抗氨基甲酰化蛋白（CarP）抗体水平及其临床意义。方法 纳入301例RA患者及55名健康体检者作为正常对照。收集患者的人口学特征和临床资料包括血清RF和抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体水平，采用ELISA检测IgG型抗CarP抗体水平。结果 根据正常对照组的第95个百分位数确定抗CarP抗体滴度的正常参考值范围为 ≤31 U/ml。在301例RA患者中，RF、抗CCP抗体及抗CarP抗体阳性率分别为74.8%（225/301）、75.1%（226/301）和15.9%（48/301）。其中RF阴性的RA患者、抗CCP抗体阴性的RA患者抗CarP抗体的阳性率分别为19.7%（15/76）和20.0%（15/75）。在RF阴性的RA患者中，若增加抗CCP抗体的检测，可使抗体阴性的RA患者减少39.5%（30/76）;若增加抗CarP抗体的检测，可使抗体阴性的RA患者减少19.7%（15/76）;若同时增加抗CCP抗体和抗CarP抗体的检测，可使抗体阴性的RA患者减少50.0%（38/76）。在46例RF和抗CCP抗体均阴性的血清阴性RA患者中，若增加抗CarP抗体的检测，可使血清阴性的RA患者减少17.4%（8/46）。结论 临床上增加抗CarP抗体的检测对血清学自身抗体阴性RA患者具有一定的补充诊断价值，血清阴性RA的诊断仍是临床目前的难点。

【关键词】类风湿关节炎;抗氨基甲酰化蛋白抗体;类风湿因子;诊断;抗环瓜氨酸肽抗体

【Abstract】Objective To probe into the level and clinical significance of anti-carbamylated protein （CarP） antibody in serologically negative patients with rheumatoid arthritis （RA）. Methods A total of 301 RA patients and 55 healthy controls were recruited. Demographic characteristics and clinical data including serum levels of rheumatoid factor （RF） and anti-cyclic citrullinated peptide （CCP） antibody were collected. Serum levels of IgG anti-CarP antibody were determined by ELISA. Results According to the 95th percentile of the anti-CarP antibody level in 55 healthy controls， the ceiling of normal value was ≤31 U/ml. Among 301 RA patients， the positive rates of RF， anti-CCP antibody and anti-CarP antibody were 74.8% （225/301）， 75.1% （226/301） and 15.9% （48/301）， respectively. The positive rates of anti-CarP antibody were 19.7% （15/76） in RA patients with negative RF and 20.0% （15/75） in RA patients with negative anti-CCP antibody， respectively. In negative-RF RA patients， additional detection of anti-CCP antibody could reduce the percentage of serologically negative RA patients by 39.5% （30/76）. Additional detection of anti-CarP antibody could lower the percentage by 19.7% （15/76）. Additional detection of both anti-CCP antibody and anti-CarP antibody could decrease the percentage by 50.0% （38/76）. In serologically negative RA patients （negative for both RF and anti-CCP antibodies）， additional detection of anti-CarP antibody could lower the percentage of serologically negative RA patients by 17.4% （8/46）. Conclusion Additional detection of anti-CarP antibody has supplementary value for the diagnosis of serologically negative RA which is currently a difficult issue in clinical practice.

【Key words】Rheumatoid arthritis; Anti-carbamylated protein antibody; Rheumatoid factor; Diagnosis;Anti-cyclic citrullinated peptide antibody

类风湿关节炎（RA）是一种常见的慢性炎症性自身免疫病，主要表现为受累关节滑膜炎症以及进行性且不可逆性软骨或骨破坏。然而，临床尚无有效的针对逆转软骨或骨破坏的治疗手段，因此RA的早期诊断与治疗尤为重要[1]。目前与RA诊断相关的血清学自身抗体主要有RF、抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体），且均已纳入2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟（ACR/EULAR）联合修订的早期RA分类标准，对早期RA的识别和诊断具有较高的临床实用价值[2]。然而，临床上仍有1/4～1/3的RA患者RF及抗CCP抗体呈血清学阴性，容易被漏诊、误诊。这部分患者是目前临床RA诊断的难点，因此探索新型自身抗体的补充诊断价值尤为迫切[3]。

2011年Shi等[4]将氨基甲酰化胎牛血清作为反应抗原，首次发现在RA患者血清中存在抗氨基甲酰化蛋白抗体（抗CarP抗体），并且发现在临床前期RA及确诊RA患者的血清均能检测出抗CarP抗体，为RA的实验室诊断提供了新的指标。目前国内关于抗CarP抗体的临床研究较少[5]。本研究采用ELISA对RA患者血清的抗CarP抗体进行了检测，旨在了解RA患者抗CarP抗体水平及其临床意义。

对象与方法

一、研究对象

纳入2011年12月至2018年7月在我科就诊的RA患者，其诊断均符合2010年ACR/EULAR联合修订的早期RA分类标准[2]。排除合并其他风湿性疾病（如SLE、系统性硬化病、皮肌炎等）、严重感染、器官功能衰竭或恶性肿瘤的患者。正常对照组选自同期我院的健康体检者。本研究获中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准（SYSEC-2009-06和SYSEC-KY-KS-012），所有参与者均已签署知情同意书。

二、临床资料收集

收集RA患者的人口学特征和临床资料，包括年龄、性别、病程及RA疾病活动指标，RA活动指标包括28个肿胀关节数（28SJC）、28个压痛关节数（28TJC）、患者总体病情活动度评估（PtGA，0～10 cm）、医生总体病情活动度评估（PrGA，0～10 cm）、疼痛视觉模拟评分（VAS， 0～10 cm）、ESR、CRP，并计算基于CRP的28个关节疾病活动度评分（DAS28-CRP）、简化疾病活动指数（SDAI）和临床疾病活动指数（CDAI）。根据CDAI，将RA病情活动度分为缓解期（CDAI≤2.8）、低度活动期（2.822.0）。

三、RF、抗CCP抗体和抗CarP抗体水平的检测

RA患者和正常对照组入组的同时留取血清，?80 ℃冻存。RF采用散射比浊法检测（德国西门子公司），正常参考值范围为0～20 IU/mL。抗CCP抗体采用ELISA检测（德国AESKU公司），正常参考值范围为0～18 IU/mL。RF和抗CCP抗体均阴性为血清阴性RA患者，RF和（或）抗CCP抗体阳性则为血清阳性RA患者。RA患者和正常对照组血清中的IgG型抗CarP抗体采用ELISA测定（美国ABSCI-BIO公司）。用标准品的吸光度作为Y轴、浓度作为X轴建立标准曲线。样本的抗CarP抗体浓度根据标准品的标准曲线得出，抗CarP抗体滴度的正常参考值范围定义为正常对照组抗CarP抗体水平的第95个百分位数。

四、统计学分析

采用SPSS 25.0进行数据分析。正态分布的连续变量资料以  表示，组间比较采用t检验。非正态分布的连续变量资料，以M（P25， P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。分类变量以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、RA患者的一般情况

本研究共纳入RA患者301例，其中女性238例（79.1%），年龄为（48.5±12.3）岁，中位病程48（13， 96）月。258例（85.7%）RA患者处于活动期，66例（21.9%）为低度活动期，101例（33.6%）为中度活动期，91例（30.2%）为高度活动期。血清阴性 RA患者共46例，占15.3%。与血清阳性RA患者相比，血清阴性 RA患者中女性占比高（91.3% vs. 76.9%）， 而其病情活动指标包括PtGA（3 cm vs. 5 cm）、疼痛VAS（3 cm vs. 4 cm）、ESR（24 mm/h vs. 41 mm/h）、CRP（5.6 mg/L vs. 10.4 mg/L）均较低（P均< 0.05），見表1。

二、抗CarP抗体滴度正常参考值范围的确定

共纳入55名健康体检者作为正常对照组，其中女40名（72.7%），年龄为（38.3±12.0）岁。以每份标准品（0、2、4、8、16、32、64 U/ml）的吸光度为Y轴，以相应的浓度为X轴建立标准曲线，读取样本抗体的浓度。由于正常对照组的抗CarP抗体滴度呈非正态分布，因此采用第95个百分位数确定抗CarP抗体滴度的正常参考值范围为≤31 U/mL，见图1。

三、RA患者抗CarP抗体的分布情况

301例RA患者中，RF、抗CCP抗体及抗CarP抗体阳性率分别为74.8%（225/301）、75.1%（226/301）和15.9%（48/301）。RF阳性和RF阴性RA患者抗CarP抗体的阳性率分别为14.7%（33/225）和19.7%（15/76），两者比较差异无统计学意义（χ? = 1.090，P = 0.297）。抗CCP抗体阳性和抗CCP抗体阴性的RA患者抗CarP抗体的阳性率分别为14.6%（33/226）和20.0%（15/75），两者比较差异无统计学意义（χ? = 1.224，P = 0.269）。血清阳性和血清阴性的RA患者抗CarP抗体的阳性率分别为15.7%（40/225）和17.4%（8/46），两者比较差异无统计学意义（χ? = 0.085，P = 0.771），见图2。

四、抗CarP抗体对血清阴性RA患者的补充诊断价值

301例RA患者中，若检测抗CarP抗体，阳性率为15.9%（48/301）。RF阴性的RA患者76例（25.2%），若增加抗CCP抗体的檢测，则可以使抗体阴性的RA患者减少39.5%（30/76）;若增加抗CarP抗体的检测，则可以使抗体阴性的RA患者减少19.7%（15/76）;若同时增加抗CCP抗体和抗CarP抗体的检测，则可使抗体阴性的RA患者减少50.0%（38/76），见图3。而在46例RF和抗CCP抗体均阴性的血清阴性RA患者中，增加抗CarP抗体检测，则可使血清阴性的RA患者减少17.4%（8/46）。

讨论

RA患者在出现临床症状、影像学及组织学变化前，即可在血清中检测到RA相关的自身抗体。RF是最早发现的RA自身抗体，可见于70%的RA患者，但特异性不强。它也可出现在RA以外的多种风湿性疾病和非风湿性疾病中，在约5%的正常人血清中也可检测到低滴度的RF。抗CCP抗体是于1998年被发现的另一种RA自身抗体，对RA的诊断具有较高的灵敏度和特异度，并且可在RA患者临床症状前4.5（0.1，13.8）年检测到，更有利于RA患者的早期诊断[6]。近年研究者发现，翻译后蛋白修饰产生自身抗体是RA的重要发病机制，修饰主要包括瓜氨酸化、氨甲酰化、乙酰化、甲基化、磷酸化等。除了RF和抗CCP抗体外，RA患者血清中还可检测到多种针对不同修饰蛋白的新型自身抗体，如抗突变型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗体、抗肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）抗体、抗瓜氨酸化α烯醇化酶多肽1（CEP-1）抗体和抗CarP抗体等[7]。这些新型自身抗体的检测是今后RA早期诊断、鉴别诊断、判断疾病的严重程度及预后评估等方面的重要研究方向。例如抗MCV抗体，有研究提示其对RA的诊断价值并不优于抗CCP抗体[8]。但在笔者团队的既往研究中，其对RA患者尤其是血清阴性的RA患者具有重要的补充诊断价值，并且与RA患者1年放射学关节破坏进展相关[9-10]。抗MCV抗体不仅能对RA诊断起到补充作用，也有助于评估病情活动及预测预后。

抗CarP抗体也属于翻译后蛋白修饰抗体，是由氨基甲酰化产生的自身抗体。氨基甲酰化的过程由氰化物介导，使赖氨酸转化为高瓜氨酸[11-13]。在生理条件下，人体内氰酸盐含量很低，并与尿素形成化学平衡。但在某些情况，如尿素水平升高、吸烟、炎症等，均可引起氰化物水平升高，继而导致氨基甲酰化水平增加，引起蛋白质和细胞功能障碍，并可破坏机体免疫耐受，导致抗CarP抗体的产生[12， 14]。文献报道，在14%～53%的RA患者血清中可检测到抗CarP抗体，其中以抗氨基甲酰化的胎牛血清抗体、抗氨基甲酰化的纤维蛋白原抗体和抗氨基甲酰化的波形蛋白抗体这3种类型最为多见[11， 15]。RA患者在出现早期症状或明确诊断之前即可在血清中检测到抗CarP抗体，且抗CarP抗体存在于几乎所有抗CCP抗体阳性以及10%～20%的抗CCP抗体阴性的RA患者体内[11]。本研究显示，RA患者抗CarP抗体的阳性率为15.9%，在抗CCP抗体阴性的RA患者中也有20%的患者抗CarP抗体阳性;但在抗CCP抗体阳性的RA患者中，抗CarP抗体的阳性率仅为14.6%，与国外文献报道不一致，提示不同地区、种族之间，抗CarP抗体可能存在一定的差异。

胎牛血清中含有氨基甲酰化蛋白质的混合物，因此实验室最常使用胎牛血清作为抗原检测抗CarP抗体[11， 13]。亦有研究者使用其他的CarP，如丝蛋白、波形蛋白、烯醇酶和胶原作为抗原[11]。国外文献大多数报道用胎牛血清氰酸化孵育过夜作为包被抗原，建立ELISA检测体系，但有文献提出此抗原制备法得到的CarP水平较低且不稳定[16]。另外，由于组成抗原表位的高瓜氨酸残基的相邻结构可能存在差异，后续诱导产生的抗CarP抗体识别的抗原表位、亲和力及结合活性不尽相同，导致抗CarP抗体在RA患者中的阳性率出现较大差异[4]。因此在抗CarP抗体作为临床诊断指标前，亟需优化CarP抗原的制备程序，同时完善检测体系，以得到更准确、稳定的结果。此外，对于抗CarP抗体的正常参考值范围的确定尚无统一的标准。目前较常见的正常上限截断值为正常人抗CarP抗体滴度平均值+2个标准差或第95个百分位数[7]。正常参考值范围的确立亦会影响诊断的阳性率，因此，纳入足够样本的正常中国人数据、确定更精确的抗CarP抗体正常界值亦是保障该领域研究进展的基石。

Verheul等[17]的研究显示，RF、抗CCP抗体和抗CarP抗体同时阳性几乎仅出现在RA患者中，而在其他类型的早期关节炎中非常罕见，对早期关节炎的鉴别诊断起到了极大的作用，对于RA的诊断具有极高的特异度（98%～100%），提示在RF和抗CCP抗体的基础上检测抗CarP抗体对于潜在RA患者的识别、早期关节炎的鉴别诊断及临床RA的诊断都具有一定的价值。本研究显示，在RF和抗CCP抗体均呈阴性的血清阴性RA患者中抗CarP抗体的阳性率为17.4%，即在检测RF和抗CCP抗体的基础上增加抗CarP抗体的检测可进一步识别17.4%的血清学阴性RA。然而，荷兰莱顿大学医学中心前瞻性队列研究纳入838例未分化关节炎患者的随访结果发现，基线检测抗CarP抗体未能提高RA早期诊断的准确性，提示抗CarP抗体对未分化关节炎发展为早期RA的预测价值仍有待进一步研究[18]。另外，对于明确诊断的RA患者，抗CarP抗体与DAS28评分之间的关系尚不明确。研究者发现，抗CarP抗体阳性与RA患者的关节破坏进展相关[19]。一项针对3个欧洲人群的纵向队列研究结果提示，抗CarP抗体阳性会增加RA患者的总病死率，提示抗CarP抗体对于RA患者的预后有一定的预测价值[20]。

总之，作为RA自身抗体的新型标志物，抗CarP抗体的检测对血清学阴性RA患者具有一定的补充诊断价值，并且在病情评估及预后预测方面有一定的潜力，值得今后进一步进行大样本且长期的前瞻性研究。

参 考 文 献

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（收稿日期：2021-09-01）

（本文编辑：林燕薇）