郑旭 ，韩燕燕 ，顾丽丽 ，李翀

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300381；2.国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381）

中国是世界上肺癌最多的国家，近年来肺癌发病率和病死率仍呈现不断攀升的趋势[1]。肺腺癌约占肺癌的50%，是肺癌最常见组织学类型，总体生存率较低[2]。肺为娇脏，肺癌的病因病机以正虚之内因为主，外因为恶毒内侵，合而生变，终成癌变。治疗上以扶正为主、解毒祛瘀。消岩汤可扶正固本，是在“解毒祛瘀，扶正抗癌”中医肿瘤治则基础上依据现代药理研究开发出的院内制剂，具有多种抗肿瘤活性，临床治疗效果较好[3-4]。但消岩汤调控肿瘤细胞的作用机制仍有待研究。本研究发现了消岩汤对肺腺癌细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响，以及消岩汤对WNT/β-catenin通路的调控作用。为消岩汤治疗肺腺癌的机制研究提供了新思路。

1 实验材料

1.1 细胞 人肺腺癌A549细胞购自ATCC。

1.2 试剂 中药消岩汤（制剂号40019）是天津中医药大学第一附属医院院内制剂，由黄芪、太子参、夏枯草、姜黄、郁金、白花蛇舌草组成。其主要化学成分为黄芪多糖、太子参环肽、夏枯草皂苷、姜黄素、齐墩果酸、熊果酸等[5-10]。经严格回流提取，其终浓度为含生药0.3 g/mL。中药消岩汤10 000 r/min，离心半径10 cm，离心3 min，用0.22 μm过滤器除菌，用培养基稀释成梯度浓度的溶液。

WNT通路激动剂SKL2001，WNT通路抑制剂XAV939，均购自美国Selleck.cn公司。CCK8（江苏凯基生物技术股份有限公司，南京），聚合酶链式反应（RT-PCR）提取试剂盒及扩增试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，北京），凋亡试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京），双荧光报告检测试剂盒（普洛麦格生物技术有限公司，北京），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（Roche Applied Science，美国）。

2 实验方法

2.1 A549肺腺癌细胞培养 A549细胞使在含10%胎牛血清的RPMI-DMEM培养液中常规培养，细胞密度达80%～90%时进行实验。

2.2 乳酸脱氢酶（LDH）检测 将A549细胞接种在96孔板中，密度为1×108/L，设3个复孔，每孔100μL，培养24 h待细胞贴壁后，分别加入不同药物，实验分组 空白对照组 、梯度浓度消岩汤组（100、50、10g/L），梯度浓度 XAV939 组（10、5、1 μmol/L），梯度浓度SKL2001 组（20、10、50 μmol/L）、消岩汤（10 g/L）加SKL2001组（10 μmol/L），继续培养 48 h后，取上清液60 μL到新的孔中，加入已经配置好的30 μL的LDH检测工作液，避光孵育30 min，测定A值（490 nm）。LDH释放率（%）＝培养液LDH含量/（培养液LDH含量＋细胞裂解液LDH含量）×100%。

2.3 CCK8法检测 将A549细胞接种于96孔板中（5 000个/孔）。实验分组对照组、为消岩汤组（浓度10g/L）、消岩汤（10g/L）加SKL2001组（10μmol/L），SKL2001 组 （10 μmol/L）、XAV939 组 （5 μmol/L）每孔 200 μL，对照组 加入 200 μL 培养基。培养 24、48、72 h后每孔加入20 μL CCK8溶液，37℃再孵育4 h后取出。检测各孔吸光度（A值）波长为490 nm，实验重复3次。

2.4 细胞凋亡率检测 药物处理细胞48 h后收集细胞，加入PBS把细胞浓度调整到2×106/mL，每组取1 mL的细胞悬液，1 000 r/min，离心半径8 cm，4℃离心10 min，在细胞沉淀中用冰预冷PBS洗涤两次，在细胞中加入缓冲液200 μL混合均匀，依次加入 5 μL 碘化丙啶（PI）和 5 μL 的膜联蛋白V-FITC（Annexin V-FITC），避光环境，室温，静置15 min，加300 μL缓冲液，用流式细胞仪分析测定对照组、XAV939组、消岩汤组、WNT通路激动剂SKL2001组及消岩汤联合SKL2001组的细胞凋亡率。实验重复3次。

2.5 RT-PCR 检测 β-catenin、c-myc、Bcl-2、Caspase-3表达情况 实验分组为对照组、中药组和XAV939组，给药后48 h提取细胞RNA，检测mRNA浓度，反转录（85℃ 45 min，4℃ 10 min）合成 cDNA。最后进行PCR扩增，根据RT-PCR试剂盒说明书，设定程序为：95℃预变性10 min，95℃变性 10 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 32 s，40个循环。内参基因为GAPDH，实验重复 3 次，2－ΔΔCt法计算 DNA 水平。反应引物见表1。

表1 聚合酶链反应引物Tab.1 Polymerase chain reaction primers

2.6 WNT通路活性检测 向各组细胞中共转染WNT信号传导通路活性报告基因质粒pGL3-OT或pGl3-OF，pRL-TK质粒为荧光素酶内对照质粒。转染48 h后检测报告基因表达情况。检测最终值为各给药组WNT通路活性比值与内对照的比值（WNT信号传导通路活性以pGL3-OT/pGL3-OF比值表示，以内对照质粒组值作为对照值），所有实验重复3次。

2.7 统计学分析 数据应用SPSS18.0软件分析。数据资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 消岩汤抑制A549细胞增殖的效果及对LDH释放的影响 为筛选最适给药浓度，应用LDH检测梯度浓度XAV939组、消岩汤组、SKL2001组细胞毒性。结果发现与对照组比较，10 μmol/L XAV939组，100 g/L和 50 g/L消岩汤组 及 20 μmol/L SKL2001组均具有显著的细胞毒性（P＜0.01）。所以为排除细胞毒性影响，选择药物浓度为5 μmol/L XAV939，10 g/L 消岩汤，10 μmol/L SKL2001（图 1A）进行后续实验。CCK8检测对照组、消岩汤组，消岩汤加SKL2001组、SKL2001组、XAV939组细胞存活率。SKL2001组与对照组比较，细胞存活率上升，说明SKL2001作用后，细胞增殖率升高。而消岩汤组、消岩汤+SKL2001组、XAV939组与对照组比较，均可抑制细胞存活率，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明3组均可以抑制细胞增殖。此外，消岩汤组细胞存活率明显低于消岩汤+SKL2001组，表明消岩汤+SKL2001组对单独消岩汤组细胞增殖的抑制有恢复作用（见图1B）。

图1 消岩汤抑制A549细胞增殖Fig.1 Xiaoyan Decoction inhibited the proliferation of A549 cells

3.2 消岩汤可促进肿瘤细胞凋亡 采用AnnexinVFITC/PI双染法检测A549细胞凋亡情况，消岩汤组、消岩汤+SKL2001组与对照组细胞晚期凋亡率、细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。结果表明，消岩汤组作用后细胞晚期凋亡明显增多，而各组早期凋亡率无明显差异。SKL2001组与对照组比较细胞晚期凋亡率减少，表明WNT通路激动剂SKL2001能够抑制肿瘤细胞凋亡。消岩汤组与消岩汤联合SKL2001组比较晚期凋亡率更高，表明消岩汤组促进细胞凋亡能力优于消岩汤联合SKL2001组，SKL2001可以减弱消岩汤的促细胞凋亡作用。而消岩汤组与XAV939组比较晚期凋亡率更高，表明消岩汤组促进细胞凋亡能力优于XAV939抑制剂组。

表2 各组A549细胞凋亡率（±s）Tab.2 Apoptosis rate of A549 cells among groups（±s）%

表2 各组A549细胞凋亡率（±s）Tab.2 Apoptosis rate of A549 cells among groups（±s）%

注：与对照组 比较，*P＜0.05；与消岩汤组 比较，#P＜0.05。

组别 早期凋亡率 晚期凋亡率 细胞凋亡率对照组 0.032±0.005 0.160±0.003 0.193±0.005消岩汤组 0.040±0.003 0.515±0.042* 0.555±0.039*消岩汤+SKL2001 组 0.037±0.001 0.234±0.030*#0.271±0.029*#SKL2001 组 0.023±0.002 0.092±0.003*#0.115±0.004*#XAV939 组 0.042±0.001 0.488±0.032* 0.530±0.032*

3.3 WNT通路相关基因β-catenin、c-myc的表达 为探究消岩汤对WNT通路的作用。检测了消岩汤组、WNT通路抑制剂XAV939组、对照组给药48 h后β-catenin、c-myc的表达。结果消岩汤组、XAV939组与对照组比较，β-catenin表达明显下调，均有统计学意义（P<0.05），各实验组与对照组比较，c-myc表达明显下调，差异均有统计学意义（P<0.05），说明消岩汤和XAV939均可以下调低β-catenin和c-myc表达，两者作用效果无明显差异。见图2。

图2 各组β-catenin、c-myc的DNA表达水平Fig.2 β-catenin and c-myc DNA expression levels in each group

3.4 消岩汤抑制WNT通路活性 转染荧光素酶报告基因质粒以检测WNT信号传导通路的活性，消岩汤、XAV939给药后WNT通路的活性显著降低，见图3。与对照组比较，WNT通路活性明显降低（P<0.05）。该检测明确了消岩汤可以降低WNT通路的活性，同时也佐证了RT-PCR实验结果与WNT通路相关性。

图3 各组中WNT通路活性表达情况Fig.3 Activity expression of WNT pathway in each group

3.5 凋亡相关基因Bcl-2、Caspase-3的表达 检测了消岩汤和XAV939抑制剂给药48 h后凋亡通路相关基因Bcl-2、Caspase-3的表达。结果消岩汤组、XAV939组与对照组比较，抗凋亡基因Bcl-2表达明显下调，差异均有统计学意义（P<0.05），说明消岩汤和XAV939均可以显著降低Bcl-2表达。各实验组与对照组比较，Caspase-3表达明显上调，差异均有统计学意义（P<0.05），见图4。

图4 各组中凋亡相关基因Bcl-2、Caspase-3的DNA表达Fig.4 DNA expression of apoptosis-related genes Bcl-2 and Caspase-3 in each group

4 讨论

WNT经典通路又称为Wnt/β-catenin通路，该通路激活后导致细胞质内β-catenin稳定并积累而不能被降解，进而进入细胞核内可激活下游靶基因的表达及转录等[11-12]。研究发现，在膀胱癌中，下调WNT通路可以提高癌细胞的化学敏感性[13]。基因表达图谱分析表明，WNT信号传导主要参与乳腺癌的扩散和转移过程[14]。在结直肠癌中，异常的WNT信号对肿瘤干细胞的肿瘤发生和维持至关重要[15]。WNT通路抑制剂XAV939与紫杉醇联合使用，可以通过抑制WNT信号传导来抑制乳腺癌的转移、血管生成和生长[16]。WNT通路抑制剂—2，4-二氨基喹唑啉，可以抑制胃癌的进展和转移[17]。随WNT/βcatenin信号在许多类型的癌症中被激活被证实，WNT通路抑制剂也逐渐成为肿瘤治疗新靶点[18-22].

近年来，无论是中药单体还是中药复方，在肿瘤治疗中的作用越来越受到重视，其作用机制研究也越来越深入。研究发现人参皂苷Rh1可以通过WNT通路抑制肺腺癌A549细胞增殖[23]。灵芝三萜可以通过WNT通路调节下游靶蛋白 c-myc、Caspase-3，CyclinD-1表达，从而调节细胞周期和凋亡[24]。益肺逐积方通过下调EGFR、GPRR30蛋白表达水平，进而抑制人肺腺癌A549细胞增殖并诱导其发生凋亡[25]。消岩汤抗肿瘤机制可能是诱导肿瘤细胞凋亡[26]。

本课题根据“扶正、解毒、祛瘀”的肺癌治疗原则，应用临床经验方剂“消岩汤”治疗肺腺癌，该制剂抗肿瘤活性强，临床应用广泛[27]。其中，黄芪、太子参共为君药，滋阴气，扶正抗肿瘤；夏枯草、牡蛎、白花蛇舌草为臣药，清热解毒，软坚散结；佐以姜黄、郁金行气散结，活血解瘀。全方扶正抗癌、解毒祛瘀，全面调节，祛邪而不伤正[28]。

本研究首先证实了消岩汤具有抑制肺腺癌A549细胞增殖、促进其凋亡的生物学特点。为进一步验证消岩汤可以通过WNT通路抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，应用消岩汤组联合WNT通路激动剂进行重复实验。首先采用CCK8测定对照组、XAV939组、SKL2001组、消岩汤组和消岩汤联合SKL2001组细胞存活率，发现后者两组均可以抑制肿瘤细胞增殖，但是消岩汤组细胞存活率明显低于消岩汤联合SKL2001组，说明消岩汤虽然可以抑制WNT通路活性，但是消岩汤联合WNT通路激动剂SKL2001后，抑制WNT通路的活性减弱了，从而对肿瘤细胞的抑制增殖作用也削减了。进一步采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测各组 A549细胞凋亡率，发现早期凋亡率各组间无明显差异。消岩汤组以诱导细胞晚期凋亡为主，且该组晚期凋亡率和细胞凋亡率均高于消岩汤联合SKL2001组，说明消岩汤组促进肿瘤细胞凋亡的能力优于联合组，推测联合组通过恢复激活WNT通路降低了消岩汤的促肿瘤凋亡能力，进一步证实了消岩汤通过下调WNT通路促进A549细胞凋亡的药理学效应。为进一步发现消岩汤对WNT信号转导通路的作用方式和机制，在裂解肺腺癌A549细胞核后，选取了RT-PCR方法和WNT通路活性分析检测核RNA的表达和WNT通路活性表达情况，结果发现对照组 A549细胞核β-catenin基因、c-myc基因表达较强；而经消岩汤作用48 h后，β-catenin、c-myc基因的表达均下调（P<0.05）。提示消岩汤可能通过抑制胞质内βcatenin蛋白入核，下调WNT信号转导通路活性，进而减少下游靶基因c-myc的表达。WNT通路活性检测也证实了消岩汤可以明显降低WNT通路活性，其作用与WNT通路抑制剂XAV939组效果基本一致。此外，通过检测各组凋亡相关基因Bcl-2、Caspase-3的表达，发现消岩汤可以显著降低抗凋亡基因Bcl-2表达，上调Caspase-3基因表达。由此，推测消岩汤可能是通过阻止β-catenin入核，下调了WNT通路活性，抑制肺腺癌细胞增殖。通过抑制WNT通路后，进而下调下游靶基因c-myc表达，并通过对凋亡相关基因Bcl-2、Caspase-3的调控促进了细胞凋亡。

综上，扶正祛瘀解毒法经典复方“消岩汤”对肺腺癌肿瘤细胞促凋亡和抗增殖作用明显，且对WNT经典通路抑制作用突出，但是本研究对机制调节的探讨尚不完善，仍有待进一步研究。