董文燊 ，周秋娟 ，林 芝 ，陈 颖 ，蒋 燕 ，李 逸 ，瞿发林 △

（1. 中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院，江苏 常州 213003； 2. 江苏省常州市武进区中西结合医院，江苏 常州 213003）

口疮穴位贴方源自中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院中药复方经验方口疮散，由生大黄、吴茱萸、细辛、肉桂、川黄连5 味中药组方［1］，具有温通经络、清热泻火、散寒止痛功效，主要用于治疗口腔溃疡。方中，大黄、黄连味苦，性寒，清热泻火，用于上焦、中焦实火上炎；吴茱萸、细辛、肉桂为温里药，用于浮越之火引火归元，导热下行，吴茱萸的主要活性成分包括吴茱萸碱和吴茱萸次碱，具有散寒止痛功效；川黄连为苦寒之药，主要活性成分为小檗碱，具有清热泻火功效。为了更好地控制口疮穴位贴的质量，保证其临床疗效，本研究中建立了同时测定其主要活性成分吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱含量的高效液相色谱法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AD 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），配有SIL - 20A 型自动进样器、SPD - M20A 型检测器；FA1004型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司，精度为十万分之一）；XS105 型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，精度为万分之一）；R201 型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式多用真空泵（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；HHS型恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）。

1.2 试药

口疮穴位贴（中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院常州医疗区制剂室自制，批号分别为20210118，20210120，20210122）；吴茱萸碱对照品（批号为110802-201710，含量按99.6%计），吴茱萸次碱对照品（批号为110801-201608，含量按99.7%计），小檗碱对照品（批号为110713 - 201814，含量按86.7%计），均购自中国食品药品检定研究院；十二烷基硫酸钠（SDS，湖南尔康制药股份有限公司，批号为101420190415）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Lichrosphe C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.015 mol/L SDS水溶液（20∶35∶45，V/V/V）；流速：1.0 mL/ min；柱温：30 ℃；检测波长：265 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

取吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱对照品各适量，精密称定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解成每1 mL分别含吴茱萸碱 86.05 μg、吴茱萸次碱 46.58 μg 和小檗碱36.69 μg的混合对照品溶液。

取口疮穴位贴5贴，除去包装及盖衬，刮取药膏，置研钵中，混匀，取1 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，称定质量，浸泡1 h，超声（功率为300 W，频率为50 kHz）40 min使溶解，放至室温，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取滤液10 mL，置圆底烧瓶中减压蒸干，残渣加热水（70～80 ℃）10 mL，超声使溶解，用 0.1 mol/ L NaOH 调 pH 至 8.5，分别用 20，10，10 mL 二氯甲烷萃取3 次，合并萃取液，减压蒸干，残渣少量多次用甲醇超声（功率为300 W，频率为50 kHz）使溶解，置 10 mL 容量瓶中，0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

按处方工艺分别制备缺吴茱萸、川黄连药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别吸取2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱的色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.Evodiamine 2.Rutecarpine 3.BerberineA.Mixed control solution B.Test solution C.Negative control solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：采用自动进样器分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液2，5，10，15，20，25 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表1。

表1 线性关系考察结果（n=6）Tab.1 Results of linear relationship test（n=6）

精密度试验：精密吸取2.2 项下混合对照品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样测定5次，记录峰面积。结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱峰面积的RSD分别为1.40%，1.67%，1.71%（n=5），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20210118）口疮穴位贴药膏5 份，各1 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱含量的RSD分别为1.36%，1.63%，1.76%（n= 5），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验项下供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h 时按 2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱峰面积的RSD分别为1.29%，1.60%，1.70%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取口疮穴位贴药膏适量，精密称定，按1∶1 精密加入含吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱的混合对照品溶液适量，加甲醇至刻度，平行制备6份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取3 批口疮穴位贴药膏1 g，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定2 次，记录峰面积，并计算含量。结果样品中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱的平均含量分别为 1.182 6，0.583 8，2.078 9 mg/ g。详见表3。

表3 样品含量测定结果（n=2）Tab.3 Results of content determination of samples（n=2）

3 讨论

3.1 流动相选择

比较了以甲醇- 乙腈- 0.015 mol/ L SDS 水溶液和乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液为流动相［2-5］时3 种待测成分的峰形及分离度，结果前者优于后者。调节甲醇- 乙腈- 0.015 mol/ L SDS 水溶液洗脱体系的比例为20∶35∶45（V/V/V）时，3 种待测成分的分离度高，峰形好，干扰少。故选择甲醇-乙腈-0.015 mol/L SDS水溶液（20∶35∶45，V/V/V）作为流动相。

3.2 检测波长选择［3］

采用紫外- 可见光扫描对照品溶液，结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱于225 nm 和290 nm 波长处均有较大吸收，小檗碱于225，265，346 nm 波长处均有较大吸收；但供试品溶液于225 nm 波长处基线平稳度较差，且其他色谱峰亦有较大吸收，影响小檗碱峰的分离度，于265 nm 和290 nm 波长处3 种生物碱成分的分离度均较好，但265 nm 波长处的吸收值高于290 nm，故选择265 nm作为3种待测成分的检测波长。

3.3 萃取溶剂选择

口疮穴位贴由5味中药饮片经粉碎后入药，化学成分复杂。预试验中采用甲醇超声提取，本研究中采用有机溶剂进行提取与纯化，曾以乙酸乙酯、二氯甲烷和乙醚作为供试品的萃取溶剂。结果二氯甲烷对吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱的综合萃取率较高，故选择二氯甲烷作为萃取溶剂。

3.4 供试品溶液pH 调节点选择

小檗碱的溶解度在稀碱溶液中提高［6-7］。本研究中采用0.1 mol/ L NaOH 溶液调节供试品溶液的pH 值（范围为7.5～9.0），对吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱的萃取率进行考察。结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱的萃取率由大至小分别为pH 8.5>pH 7.5>pH 9.0>pH 8.0，pH 7.5 > pH 8.5 > pH 8 > pH 9.0，pH 9.0 >pH 8.5>pH 7.5>pH 8.0。综合比较，最终以pH 8.5作为供试品溶液的pH调节点。

3.5 方法评价

本方法操作简便快速、重复性好、结果准确，可用于同时测定口疮穴位贴中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和小檗碱的含量。