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培土清热解瘀方对DR 大鼠炎性因子、血管生成及凋亡的影响

2022-04-19姚月蓉朱蓓菁钱锦唐建明

中国中医眼科杂志 2022年3期
关键词:细胞因子视网膜炎症

姚月蓉,朱蓓菁,钱锦,唐建明

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的一种常见的微血管并发症,也是世界各地劳动年龄人群视力障碍和失明的主要原因[1-2]。而糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)是DR的重要表现,可出现在DR 的任一阶段。有研究[3-4]表明,培土清热解瘀方(PQJ)能显著增强康柏西普玻璃体注射及激光光凝的治疗效果,改善视力,减轻DME,并降低复发率。但PQJ 对DR 是否具有治疗作用尚不明确。本研究采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)构建DR 大鼠模型,并给予不同剂量的PQJ 药液进行灌胃治疗,分析PQJ 对DR 大鼠血清中炎症细胞因子、视网膜组织中血管生长因子和细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SPF 级SD 大鼠100 只,体重(200±25)g,购于上海市计划生育科学研究所实验动物经营部,生产许可证号:SCXK(沪)2018-0006。饲养实验室温度18℃~25℃,相对湿度40%~70%。本研究获得上海市宝山区中西医结合医院伦理委员会批准,伦理审批号:201812-04。

1.2 试剂、仪器与药品

肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素-6 (interleukin-6,IL-6) 酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 试剂盒(上海信裕生物科技有限公司,XY-E30635、XY-E30646),鼠抗血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)抗体、鼠抗血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)抗体、鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)抗体(赛默飞世尔科技公司,MA1-16629、PA5-104882、PA5-105271),人抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)抗体(美国Abcam 公司,ab49822),苏木素、伊红(珠海贝索生物技术公司,714094、BA4099)。

石蜡切片机 (徕克医疗仪器公司,SQ2125),电泳仪 (美国BIO-RAD 公司,mini protean 3 cell)、电转仪(大连竞迈科技有限公司公司,PS-9),酶标仪(芬兰雷勃公司,MK3)。

PQJ 水煎剂:PQJ 由党参15 g、黄芪30 g、生地30 g、白术10 g、猪苓15 g、茯苓15 g、陈皮10 g、半夏10 g、三七2 g、知母10 g、黄柏10 g、黄芩10 g、黄连5 g、玉米须10 g、甘草5 g 组成。生药购于上海市宝山区中西医结合医院中药房,由雷允上药业集团有限公司提供。取PQJ 生药,加入10 倍量水浸泡0.5 h,煎煮1.5 h,滤过,药渣加入8 倍量水,煎煮1.5 h,合并2 次所得药液,浓缩(药液与药材比例1∶1),无菌阴干制备成药物浸膏,使用前加入适量体积水溶解成需要浓度。

1.3 DR 大鼠模型建立

选用100 只SD 大鼠适应性喂养7 d 后,随机挑选10 只设为正常对照组(control group,CG),其余大鼠腹腔注射STZ 溶液(60 mg/mL,注射前禁食不禁水16 h),注射后分别于72 h 和每周测定大鼠空腹血糖,连续测量8 周,以血糖值≥16.7 mmol/L 者确定为糖尿病大鼠。根据文献方法[5],继而用微量进样器抽取0.05 μg 的VEGF,于颞侧角膜缘后2 mm 水平经过睫状体平坦部进入玻璃体腔,缓慢推动进样器留针10 s,4 周后对玻璃体腔注药的大鼠分批行眼底荧光血管造影 (fundus fluorescein angiography,FFA)检查,造影出现背景荧光增强、血管迂曲扩张、新生血管荧光渗漏等表现者为DR 造模成功。

1.4 分组与给药

筛选出造模成功的DR 大鼠40 只,随机分为PQJ 低、中、高剂量组(LPQJ、MPQJ、HPQJ)和模型组(model group,MG),以及模型建立前所设立的CG组,共5 组,每组10 只。HPQJ 组每天灌胃中药液相当于12 倍成人剂量(37.44 g/kg),MPQJ 组为6 倍成人剂量(18.72 g/kg),LPQJ 组为3 倍成人剂量(9.36 g/kg)。CG 组与MG 组每天给予蒸馏水灌胃,每组均连续灌胃3 个月,每日2 次,1 mL/次。

1.5 HE 染色法评价模型和治疗效果

取大鼠眼球壁常温固定24 h,行石蜡包埋切片,常规脱蜡至水,将已入蒸馏水后的切片放入苏木素水溶液中染色5 min,流水冲洗15 min,酒精脱水后伊红染色液染色1~2 min,染色后的切片经纯酒精脱水。二甲苯透明后中性树胶封片,放入65℃烘箱中15 min。通过显微镜拍照,采集分析样本相关部位。

1.6 ELISA 法检测大鼠血清中TNF-α 和IL-6 的含量

收集各组大鼠视网膜组织,使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1000×g 离心10 min 将血清和红细胞迅速小心分离,先加稀释液40 μL,然后再加血清样本10 μL,37℃温育30 min,加入酶标试剂50 μL,温育30 min,洗涤,37℃避光显色15 min,加终止液,测量各孔的吸光度。

1.7 qRT-PCR 检测血管生成因子VEGF 和VEGFR2 的相对表达量

采用Trizol 法提取视网膜组织RNA,使用DNaseⅠ消除RNA 中的DNA 后,采用逆转录试剂盒制备cDNA,后使用SYBR Green 试剂在ABI Prism 7300仪器上进行PCR 扩增,各基因所用引物序列如表所示(表1)。所得数据采用仪器自带软件进行分析。

表1 引物信息

1.8 Western blot检测VEGF、VEGFR2、Caspase-3和Caspase-9 的相对表达量

提取视网膜组织蛋白,测定蛋白浓度并进行蛋白定量,经凝胶、电泳和转膜后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,加入一抗 (VEGF、VEGFR2、Caspase-3、Caspase-9 和GAPDH)室温孵育2 h,后将膜冲洗之后加入二抗37°C 孵育1 h,最后采用化学发光显影,以GAPDH 为内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.9 统计学方法

采用SPSS21.0 统计软件对数据进行分析,计量资料数据采用均数±标准差(±s)表示,符合正态分布且方差齐的计量资料,方差分析(ANOVA)进行多组变量间的相互比较,两两比较,采用LSD-t 检验,当P<0.05 时被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PQJ 对DR 大鼠视网膜形态和血清TNF-α 和IL-6 水平的影响

HE 染色实验显示DR 模型成功建立,同时MPQJ 的视网膜形态接近CG,说明PQJ 可以改善DR(图1)。ELISA 结果显示,5 组间大鼠血清TNF-α和IL-6 水平比较,差异有统计学意义(FTNF-α=10.023,FIL-6=8.920,均P=0.000)。两两比较,(1)TNF-α 表达:与CG 比较,MG 血清TNF-α 升高(t=5.514,P=0.000);与MG 比较,MPQJ 和HPQJ 血清TNF-α 降低(tMPQJ=3.081,P=0.006;tHPQJ=4.624,P=0.000);与MPQJ 比较,HPQJ血清TNF-α 降低(t=3.070,P=0.007),差异均有统计学意义。(2)IL-6 表达:与CG 比较,MG 血清IL-6 升高(t=4.998,P=0.000);与MG 比较,HPQJ 血清IL-6降低(t=4.219,P=0.001),差异均有统计学意义(表2)。

表2 PQJ 对DR 大鼠血清炎性因子和视网膜凋亡因子水平的影响(±s,n=10)

表2 PQJ 对DR 大鼠血清炎性因子和视网膜凋亡因子水平的影响(±s,n=10)

注:* 与CG 相比,P<0.05;# 与MG 相比,P<0.05;PQJ 培土清热解瘀方;DR 糖尿病视网膜病变;TNF-α 肿瘤坏死因子-α;IL-6 白细胞介素-6;Caspase-3 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3;Caspase-9 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9;CG 正常对照组;MG 模型组;LPQJ、MPQJ、HPQJ 培土清热解瘀方低、中、高剂量组

2.2 PQJ 对DR 大鼠视网膜中VEGF 和VEGFR2的mRNA 和蛋白表达的影响

5 组间大鼠视网膜中VEGF 和VEGFR2 的mRNA 和蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(mRNA:FVEGF=13.559,FVEGFR2=12.969,均P=0.000;蛋白:FVEGF=28.597,FVEGFR2=32.244,均P=0.000)。两两比较,(1)VEGF表达:与CG比较,MG大鼠视网膜VEGF mRNA 表达升高(t=6.598,P=0.000)、VEGF 蛋白表达升高(t=8.391,P=0.000),与MG 比较,MPQJ和HPQJ 大鼠视网膜VEGF mRNA 表达降低(tMPQJ=4.414,tHPQJ=5.084,均P=0.000),HPQJ 组VEGF 蛋白表达降低(t=7.117,P=0.000),差异均有统计学意义。(2)VEGFR2 表达:与CG比较,MG大鼠视网膜VEGFR2 mRNA 表达升高(t=6.378,P=0.000),VEGFR2 蛋白表达升高(t=10.683,P=0.000),差异均有统计学意义。与MG 比较,MPQJ 和HPQJ 大鼠视网膜VEGFR2 mRNA 表达降低(tMPQJ=3.625,P=0.002;tHPQJ=4.228,P=0.000),LPQJ、MPQJ 和HPQJ 组VEGFR2蛋白表达降低(tLPQJ=4.312,tMPQJ=4.656,tHPQJ=7.736,均P=0.000),差异均有统计学意义(表3、图2)。

表3 PQJ 对DR 大鼠VEGF 和VEGFR2 的mRNA 和蛋白表达的影响(±s,n=10)

表3 PQJ 对DR 大鼠VEGF 和VEGFR2 的mRNA 和蛋白表达的影响(±s,n=10)

注:* 与CG 相比,P<0.05;# 与MG 相比,P<0.05;PQJ 培土清热解瘀方;DR 糖尿病视网膜病变;VEGF 血管内皮生长因子;VEGFR2血管内皮生长因子受体2;CG 正常对照组;MG 模型组;LPQJ、MPQJ、HPQJ 培土清热解瘀方低、中、高剂量组

2.3 PQJ 对DR 大鼠视网膜Caspase-3 和Caspase-9 表达的影响

5 组间大鼠视网膜Caspase-3 和Caspase-9 的蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(FCaspase-3=48.538,FCaspase-9=51.669,均P=0.000)。两两比较,(1)Caspase-3 表达:与CG 比较,MG 大鼠视网膜Caspase-3 蛋白表达升高(t=12.332,P=0.000);与MG 比较,HPQJ 大鼠视网膜Caspase-3 蛋白表达降低 (t=7.370,P=0.000),差异均有统计学意义。(2)Caspase-9 表达:MG 大鼠视网膜Caspase-9 蛋白表达升高(t=10.659,P=0.000);与MG 比较,MPQJ 和HPQJ 大鼠视网膜Caspase-9 蛋白表达量降低(tMPQJ=7.251,tHPQJ=9.161,均P=0.000),差异均有统计学意义(表2、图3)。

3 讨论

DR 是一种以炎症反应和新生血管生成为特征的视网膜微血管病变[6-8]。多种炎症细胞因子如TNFα、IL-6、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)和肿瘤坏死因子-β(tumor necrosis factor-β,TNF-β)等在糖尿病患者和动物模型的视网膜组织中显著升高,且其浓度随DR 的发展而逐渐增加[7,9]。临床研究[10-11]显示,糖尿病患者房水中IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α 等炎症细胞因子水平随新生血管的发展逐渐升高,且水平越高则出现视网膜并发症的时间就越早,可见炎症细胞因子在DR 的发病机制中起到一定作用。已有报道[12-14]显示,多种中药能通过抑制炎症细胞因子的水平缓解DR。

中医界较一致地认为DR 是由于糖尿病发病日久,阴虚津亏,不能上承目络,目窍失养;或肝肾阴虚目甚,阴虚阳亢,虚火上炎,灼伤目络而致视物模糊,甚则失明[15]。PQJ 是上海市曙光医院眼科老中医朱炜敏教授多年临床经验方,方以清理三焦内热的基础上,加益气养阴,配以消肿、活血、散瘀药物治疗。用党参、黄芪益气,生地、知母养阴,黄芩、黄连、黄柏清热,白术、茯苓培补脾土,猪苓、茯苓利水消肿,半夏化痰湿,三七活血,甘草调和诸药。与已有动物研究[13,16-17]相一致,本研究中STZ 诱导的DR 大鼠视网膜组织中炎症细胞因子TNF-α 和IL-6 的含量显著增加。而PQJ 灌胃治疗能显著降低DR 大鼠视网膜组织中炎症细胞因子TNF-α 和IL-6 的水平,可见PQJ 能减轻DR 大鼠炎症反应,从而降低视网膜组织的损伤。

临床研究[18]显示,DR 病人随着病情的加重,促血管生成因子VEGF 及其受体水平显著升高。高血糖诱导的糖代谢异常、脂质过氧化、晚期糖基化、谷氨酸毒性和氧化应激诱导视网膜毛细血管细胞凋亡,继而增加VEGF 及其受体VEGFR2 的表达,是糖尿病微血管病变发生的关键因素[19]。STZ 诱导的DR 大鼠在发病后视网膜内血管数增加,VEGF 及其受体VEGFR1 和VEGFR2 的表达增强[13,20-21]。因此,可见VEGF 及其受体参与DR 的发生过程。针对VEGF 或VEGF 受体的治疗物,如Decursin,呈剂量依赖地抑制VEGFR2 的表达,显著抑制糖尿病视网膜新生血管[22]。在人视网膜微血管细胞中沉默硫氧还蛋白互作蛋白 (thioredoxin-interactingprotein,TXNIP)基因,可以通过阻断VEGFR2 抑制VEGF 诱导的血管生成反应[23]。本实验研究证实DR 模型大鼠视网膜组织中VEGF 和VEGFR2 的表达显著高于正常对照组,而PQJ 能明显抑制VEGF 和VEGFR2 的表达,且剂量越高抑制作用越强,说明PQJ能抑制VEGF 和VEGFR2 的水平,可能进一步通过抑制新生血管生成达到改善DR 的目的。

视网膜血管周细胞凋亡是公认的DR 最早的改变。高血压状态的周期性拉伸能诱导Caspase-3 和Caspase-9 的活性升高,诱导视网膜周细胞凋亡,从而加重早期糖尿病视网膜病变[24]。与正常视网膜相比,糖尿病视网膜神经节细胞层中活性Caspase-3和Caspase-9 的表达增强,其上调与糖尿病视网膜病变的神经元变性有关[25]。本研究中PQJ 能明显降低STZ 诱导的DR 大鼠视网膜组织中凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的增加。因此,PQJ 能通过调控视网膜组织细胞的凋亡,在DR 的防治中产生作用。

综上所述,本研究结果显示,PQJ 能显著降低DR 大鼠炎症细胞因子TNF-α 和IL-6 的水平,抑制血管生成因子VEGF 和VEGFR2 的表达,抑制细胞凋亡相关蛋白,从而进一步调控DR 大鼠视网膜血管新生、炎性反应和细胞凋亡,为PQJ 应用于临床治疗DR 提供了有效的实验依据。

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