王海雨，王 然

南京医科大学附属淮安第一医院医学检验中心，江苏淮安 223001

超过90%的人类转录体不具备蛋白质编码能力，但可以转录为非编码RNA(ncRNA)，包括微小RNA(miRNA)，长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)[1]。circRNA由前体mRNA反向剪接而成，具有环形共价闭合结构，对核酸外切酶的耐受性更高，因而具有更高的稳定性[2]。研究人员已在各种生物体中鉴定出数千种circRNAs，它们在许多疾病(尤其是各类癌症)中起到了关键作用[3-6]。circRNA通过与miRNA结合充当“miRNA海绵”，通过影响其对目的转录体的降解发挥间接调控的作用。转录组数据分析发现：环状Y样结构域(circCDYL)与RNA结合蛋白(RBP)的相互作用促进膀胱癌细胞的增殖和转移，且与患者的不良预后相关[7-8]。目前关于circCDYL在肝细胞癌(HCC)中的作用尚未完全阐明，故本研究探讨了HCC组织及癌旁组织中circCDYL的表达差异，同时分析了HCC组织中circCDYL的表达与患者临床资料的关系及对预后的影响，运用体外细胞实验验证了circCDYL对HCC迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1标本及细胞系来源 cDNA芯片(包括90对HCC组织和癌旁组织标本提取RNA后逆转录为cDNA)由芯超生物科技有限公司提供，包括完整的临床/病理参数及随访资料，手术时间从2007年6月至2008年11月，随访截至2012年3月，随访期间死于HCC的患者32例，患者术前均未接受任何治疗。4株HCC细胞(HepG2、QGY-7703、MHCC97-H、SMMC-7721)和1株正常肝脏上皮细胞(LO2)由中科院生物化学研究所(上海)提供，细胞在含有10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培养基、37 ℃、5% CO2孵育箱中培养。

1.2方法

1.2.1circCDYL表达水平检测 使用总RNA抽提试剂提取HCC细胞株及正常肝脏上皮细胞的RNA，之后逆转录为cDNA。使用qPCR试剂在伯乐T100 PCR仪上检测细胞株和芯片中circCDYL表达水平。以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为circCDYL的内参，测得circCDYL与GAPDH的阈值循环数(Ct)，运用2—ΔΔCt公式计算circCDYL的相对表达量。以上检测重复5次。将90例HCC组织按circCDYL相对表达水平排序，低于中位数定义为circCDYL低表达组，高于中位数则定义为circCDYL高表达组。

1.2.2细胞转染 敲减circCDYL的3条小干扰RNA(siRNA)由吉凯基因有限公司(上海)提供。将4×105个细胞均匀铺在6孔板中孵育，当细胞密度达到60%～70%时，转染siRNA和阴性对照序列，孵育48～72 h后收集细胞并提取RNA，检测circCDYL的敲减效率。circCDYL、GAPDH引物及siRNA寡核苷酸序列见表1。

表1 实验所用引物及siRNA寡核苷酸序列

1.2.3细胞迁移及侵袭实验 使用无血清DMEM培养基调整细胞密度约5×105～6×105个/mL，吸取300 μL悬液加入上层小室中(侵袭实验在迁移实验基础上多铺一层凝胶)，加入500 μL 10% FBS培养液在下层小室；孵育24 h，将未通过孔筛的细胞拭去，而将通过孔筛的细胞使用甲醛固定、结晶紫染色，在普通光学显微镜下计数。

2 结 果

2.1HCC组织与癌旁组织中circCDYL表达水平的比较 HCC组织中circCDYL相对表达水平(4.01±1.63)高于癌旁正常组织(0.74±0.21)，差异有统计学意义(t=17.37,P<0.05)。

2.2HCC组织中circCDYL相对表达水平与患者临床/病理参数的关联性 HCC组织中circCDYL表达与HBsAg状态、血管浸润、肝硬化结节个数、淋巴结转移、TNM分期、复发情况、PD-L1和CTLA-4状态有关联，差异均有统计学意义(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤最大径及血清AFP水平等均无关联(P>0.05)，见表2。

表2 HCC组织中circCDYL的相对表达水平与患者临床/病理参数的关联性[n(%)]

续表2 HCC组织中circCDYL的相对表达水平与患者临床/病理参数的关联性[n(%)]

2.3circCDYL对HCC细胞系迁移和侵袭能力的影响 对4株HCC细胞(HepG2、QGY-7703、MHCC97-H、SMMC-7721)和1株正常肝脏上皮细胞(LO2)中circCDYL表达进行检测，结果发现4株HCC细胞中circCDYL相对表达水平(4.50±0.30、2.93±0.21、2.37±0.15、1.60±0.10)均高于正常肝脏上皮细胞(1.00±0.20)，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1A。选取HepG2转染3个siRNA用以敲减circCDYL，其中siRNA-1效果最显著(P<0.001)，见图1B。选择siRNA-1转染的细胞进行后续迁移、侵袭实验，敲减circCDYL后，HepG2细胞的迁移和侵袭能力均下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

注：A为4种HCC细胞与正常肝脏上皮细胞(LO2)中circCDYL相对表达水平比较；B为HepG2细胞系转染siRNA后敲减效果的比较；***表示P<0.001，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

注：A、C表示HepG2细胞转染siRNA-1后迁移能力明显下降；B、D表示HepG2细胞转染siRNA-1后侵袭能力明显下降；***表示P<0.001；si-NC为对照；si-circCDYL为采用siRNA-1敲减circCDYL；放大倍数为100。

2.4circCDYL相对表达水平与HCC患者预后之间的关联性 经生存分析，对TNMⅠ～Ⅲ期(作为整体)、Ⅰ期、Ⅱ期的HCC患者分别进行生存分析，circCDYL高表达患者总体生存率均低于低表达患者，差异具有统计学意义(Log-rankχ2=52.06、30.65、15.49，P<0.05)；circCDYL高表达患者无复发生存率均低于低表达组，差异有统计学意义(Log-rankχ2=38.24、28.13、7.63，P<0.05)；见图3。Cox比例风险模型探讨影响HCC患者不良预后的暴露因素，发现circCDYL高表达是HCC患者不良预后的独立危险因素(HR=22.712，P<0.05)，见表3。

注：A、D为对80例TNMⅠ～Ⅲ期HCC患者进行的评估；B、E为对39例TNMⅡ期患者进行的评估；E、F为对36例Ⅲ期患者进行的评估。

表3 Cox回归分析影响HCC患者预后的因素

续表3 影响HCC患者预后的暴露因素相关Cox回归分析

3 讨 论

本研究发现，HCC组织中circCDYL相对表达水平显著高于癌旁组织，这表明circCDYL可能参与了HCC的发生，其异常表达可能促进肝脏正常上皮细胞过度增殖，其长期作用会促进肿瘤形成。肿瘤细胞发生转移一般先侵袭上皮细胞基底面的附着层或微血管，再经过淋巴循环或血循环形成远处转移，因此肿瘤细胞亚型是否具有侵袭性、有无局部淋巴结转移或血管浸润对预后判断起到十分关键的作用[9-12]。进一步分析发现：circCDYL表达与淋巴结转移和局部血管浸润有关；体外迁移和侵袭实验验证circCDYL能促进HCC细胞的迁移和侵袭，提示circCDYL可能有促进肿瘤细胞发生局部侵袭及远处转移的作用，同时circCDYL表达水平与患者TNM分期及复发情况也有关。TNM分期和复发是反映肿瘤进展的重要指标，TNM分期越高，患者预后往往不佳[13-14]，治疗后肿瘤复发往往会导致患者的生存期大幅缩短，对患者的预后有十分不利的影响[15-16]，以上结果提示circCDYL与HCC的发展密切相关。circCDYL的表达与PD-L1和CTLA-4呈阳性有关，PD-L1和CTLA-4是肿瘤逃脱免疫监视和清除的重要分子，目前新兴肿瘤治疗的靶点多针对PD-L1和CTLA-4[17-18]，提示circCDYL可能通过促进PD-L1和CTLA-4表达促进HCC发生、发展，该推论需要进一步的机制研究来验证。既往研究表明，circCDYL具有促进套细胞淋巴瘤细胞增殖的功能[19]；但本研究发现circCDYL表达与肿瘤最大径无关，推测circCDYL与HCC细胞增殖无关，这种差异可能由于组织特异性造成的。

本研究针对不同TNM分期的HCC患者进行分析，发现circCDYL高表达者的总体生存率和无复发生存率均低于低表达者，同时多因素回归分析发现HCC组织中circCDYL高表达是促进患者不良预后的独立危险因素。以上结果提示circCDYL对HCC患者预后判断可能具有一定价值，其高表达提示HCC患者预后不良。

综上所述，circCDYL在HCC组织中的表达水平显著高于癌旁组织，其可能促进了HCC细胞的迁移和侵袭，后期仍需体内实验的进一步验证。其高表达提示HCC患者预后不良，有望成为新的诊断和预后标志物。