摘要：CsBLH7与CsKNAT4分别属于BELL类蛋白与KNOX类蛋白，可能与植物器官形态建成密切相关，但目前几乎没有关于CsBLH7与CsKNAT4蛋白互作的深入研究报道。采用酵母双杂交初步确定CsBLH7与CsKNAT4能够在细胞体内互作，形成BLH7-KNAT4蛋白复合物。双分子荧光互补（BiFC）进一步确定了这种互作关系。原生质体瞬时转染试验结果表明，CsBLH7与CsKNAT4分别为转录抑制因子与转录激活因子。同时，针对35S：CsBLH7、35S：CsKNAT4材料的形态分析结果表明，下胚轴细胞长度分别缩短与伸长，这与它们的转录活性相适应。再者，35S：CsBLH7、35S：CsKNAT4遗传材料的赤霉素合成酶基因分别下调与上调。研究结果表明，BLH7-KNAT4可能是通过调节赤霉素合成来调控下胚轴细胞长度，对揭示CsBLH7和CsKNAT4调控植物形态建成分子机理具有重要意义。

关键词：CsBLH7;CsKNAT4;蛋白互作;BiFC;下胚轴细胞;转录活性;植物形态建成

中图分类号： S563.301  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）06-0041-04

收稿日期：2021-06-11

基金项目：黑龙江省自然科学基金（编号：LH2020C097）;黑龙江省农业科学院国自然培育项目（编号：2019JJPY003）;黑龙江省麻类科技创新基金（编号：MLCX-20）;特色经济作物绿色种植技术示范推广项目（编号：KYBG-05WDL-2020001）。

作者简介：张利国（1978—），男，黑龙江哈尔滨人，博士，助理研究员，主要从事麻类分子育种研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

BELL类蛋白几乎存在于所有植物当中[1]，大麻中目前发现有13个BELL蛋白[2]。现有研究揭示，BLH1能够调节植株花基形态，在生殖生长与营养生长的转换节点可能发挥重要负调控功能;在拟南芥中BLH3和BLH6的转录活性相反，同时还可能参与调节植株叶片的形态与花期[3]。

KNOX家族作为TALE蛋白的一个亚类，也能够从多方面参与对植物形态建成的调控。不同物种的同源BELL和KNOX蛋白可能存在不同的蛋白互作关系[4-5]。研究的前期工作基础初步表明，CsBLH7可能与CsKNOXs家族部分成员之间存在蛋白互作关系。对比大麻的全基因组测序数据，在大麻中发现6个KNOX蛋白和13个BELL蛋白，因此确定它们之间的互作关系、调节方式，对解析大麻器官形态发生的机制是十分必要的，将是揭示CsBLH7调控基因表达分子机理的基础与关键。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中植物材料为工业大麻新品种龙大麻4号，由黑龙江省农业科学院经济作物研究所选育。龙大麻4号的THC （四氢大麻酚）含量低于千分之一，为高产高纤型工业大麻品种。

1.2 酵母双杂交相关质粒构建与测试蛋白-蛋白互作

采用PCR方法通过对大麻cDNA进行克隆获取BLH7和KNAT4的开放读码框片段。在酵母细胞中，转入BLH7的同源异型结构域蛋白片段与 Bell-like 片段，在pvgDT3中插入BLH7与BLH10的cDNA。在缺乏Trp及缺乏Leu的培养基中筛选酵母细胞，以测试其蛋白互作关系，在缺少Ade与Leu，以及无Trp、无His的培养基中培养筛选后的株系。使用阴性对照Pgatd7SV（40）和Pgbkt （7）Lam，阳性对照是Pgatd7SV （40）与Pgbkt （7）p53。

1.3 采用双分子荧光互补技术（BiFC）测试蛋白-蛋白互作

通过35S启动子的调控，黄色荧光蛋白的两端[4]分别连接BLH蛋白与KNOX蛋白形成融合蛋白，即C-KNAT4 与N-BLH7。扩增完成后，在pSAT6-nEYFP-N1中亚克隆KNAT4-YFPC、KNAT3-YFPC，在pSAT6-cEYFPN1中亚克隆BLH7-YFPN、BLH10-YFPN，参考Yoo等聚乙二醇转染拟南芥原生质体的试验方法[4]展开试验，于Leica 2PS SSC 激光共聚焦显微镜下观察荧光成像情况。

1.4 原生质体瞬时转染试验

在pUC19质粒中构建35S：GD-OIPs，用于质粒提取和扩增。反式强激活作用因子Ld-Vp16，以及报告基因2 LexA-2 Gal4：Gus和2Gal4：Gus也在本试验中应用。本试验采用无内毒素转染级质粒试剂盒（Abcam）进行报告质粒和效应因子的分析，至少重复进行3次生物学试验和设置2次技术性重复，数据分析处理采用t检验。研究采用Gal4 DNA-binding domain和LexA DNA-binding domain，对应GD-OIPs与VP16，其可靠性已被反复证实，例如AUX/IAA蛋白[6]、OFP4蛋白[7]。

2 结果与分析

2.1 酵母双杂交测试CsBLH7与CsKNAT4之间的蛋白互作

通过酵母双杂交试验测试CsBLH7与KNAT4在体内的相互作用，CsBLH7与转录蛋白因子的结合域连接组成融合蛋白，KNAT4与转录激活域形成融合蛋白。为排除目标蛋白可能的自激活活性，测试结合域蛋白-Oips与激活域蛋白-Empty蛋白互作。试验结果表明，CsBLH7、KNAT4均无自激活活性，CsBLH7与CsKNAT4在体内存在蛋白互作关系，形成BLH7-KNAT4蛋白復合物。CsBLH7与CsKNAT4酵母双杂交（图1）。在缺乏Leu与缺乏Trp的培养基质中，Yeast-cell首先被选择，在缺Leu、缺Trp、无His与无Ade的培养基质中培养5～6 d，完成BLH-KNOX蛋白-蛋白互作测试。

2.2 雙分子荧光互补（BtFC）研究BLH7与KNAT4蛋白互作

由于酵母双杂交技术上的局限性，为进一步证实BLH7与KNAT4在细胞体内的蛋白互作，采用双分子荧光互补方法进行测试。试验采用拟南芥叶肉原生质体，共转染YFPC-CsKNAT4与YFPN-CsBLH7，试验体系采用RACK1-C-EYFP作为阴性对照。BiFC试验结果显示，BLH7与KNAT4蛋白互作发生在细胞核中（图2）。

2.3 BLH7与KNAT4转录活性测试

从原生质体瞬时转染效应因子相对表达量可知，图中GD-BLH7的GUS相对表达量明显降低（图3），GD-KNAT4的GUS相对表达量明显上调（图3、图4），由此可知CsBLH7为转录抑制因子，CsKNAT4为激活因子，且CsBLH7能够与CsKNAT4互作，并能够抑制CsKNAT4的转录激活活性（图5）。

2.4 CsBLH7-CsKNAT4调节下胚轴细胞的伸长

在过去针对BELL与KNOX类蛋白研究的结果表明，二者能够调节植株的形态发育，包括叶片的形状、茎的长度、花基发育等。对比野生型（Col），35S：CsBLH7下胚轴长度与下胚轴细胞长度明显缩短，35S：CsKNAT4下胚轴长度明显伸长（图6、图7）。

在水稻、拟南芥等植物中过去关于BELL与 KNOX蛋白的研究曾报道，BELL-KNOX通过调控赤霉素合成酶基因来调节茎与细胞的伸长。为进一步探究CsBLH7-CsKNAT4调节胚轴与茎细胞长度的机制，对不同遗传背景材料的赤霉素合成酶基因做荧光定量分析。结果表明，35S：CsBLH7中CsGA20ox1表达量均降低，35S：CsKNAT4中CsGA20ox1表达量上升（图8）。

3 讨论

研究采用酵母双杂交初步确定，CsBLH7与

CsKNAT4能够在细胞体内互作，形成BLH7-KNAT4蛋白复合物，双分子荧光互补（BiFC）进一步证实了这种蛋白互作。以拟南芥原生质体为材料，为确定转录蛋白的作用开展瞬时转染，通过酶标仪以GUS基因相对表达量，确定CsBLH7为转录抑制因子，35S：CsKNAT4为转录激活因子。材料35S：CsBLH7下胚轴与细胞长度降低，材料35S：CsKNAT4下胚轴与细胞长度增加。BLH7与KNAT4互作形成BLH7-KNAT4蛋白复合物，BLH7能够抑制茎与胚轴细胞的伸长，KNAT4能够促进茎与胚轴细胞的发育，这与BLH7作为一个转录抑制因子，KNAT4作为一个转录激活因子的遗传特性相适应。结合不同材料CsGA20ox1的表达量，在BLH7与KNAT4蛋白互作基础上，暗示BLH7-KNAT4可能是通过调节赤霉素合成来调控下胚轴与茎细胞长度，从而影响下胚轴的发育。

同时，在过去的报道中，OFP等其他转录蛋白可能与BELL-KNOX蛋白复合物发生互作来发挥调控作用，形成OFP-BELL-KNOX复合蛋白[8-9]，本研究中KNAT4与BLH7的蛋白-蛋白互作，也可能并不是直接形成的，并不能排除是通过其他蛋白间接形成的互作，这需要通过体外蛋白互作试验进一步来确定。

参考文献：

[1]Arnaud N，Pautot V. Ring the BELL and tie the KNOX：roles for TALEs in gynoecium development[J]. Frontiers in Plant Science，2014，5：93.

[2]Kumar R，Kushalappa K，Godt D，et al. The Arabidopsis BEL1-LIKE HOMEODOMAIN proteins SAW1 and SAW2 act redundantly to regulate KNOX expression spatially in leaf margins[J]. Plant Cell，2007，19（9）：2719-2735.

[3]Gomez-Mena C，Sablowski R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE1 establishes the basal boundaries of shoot organs and controls stem growth[J]. Plant Cell，2008，20（8）：2059-2072.

[4]Yoo S D，Cho Y H，Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts：a versatile cell system for transient gene expression analysis[J]. Nature Protocols，2007，2（7）：1565-1572.

[5]Furumizu C，Alvarez J P，Sakakibara K，et al. Antagonistic roles for KNOX1 and KNOX2 genes in patterning the land plant body plan following an ancient gene duplication[J]. PLoS Genetics，2015，11（2）：e1004980.

[6]Oh E，Zhu J Y，Bai M Y，et al. Cell elongation is regulated through a central circuit of interacting transcription factors in the Arabidopsis hypocotyl[J]. eLife，2014，3：e03031.

[7]Giacomo E D，Sestili F，Iannelli M A，et al. Characterization of KNOX genes in Medicago truncatula[J]. Plant Molecular Biology，2008，67（1/2）：135-150.

[8]Zhou H B，Liu B，Weeks D P，et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J]. Nucleic Acids Research，2014，42（17）：10903-10914.

[9]Tzfira T，Tian G W，Lacroix B，et al. pSAT vectors：a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants[J]. Plant Molecular Biology，2005，57（4）：503-516.