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酚酸类化感物质种类、提取、分离和检测研究进展

2022-04-15程佳王发啟李小双杜亚东谢越

江苏农业科学 2022年6期
关键词:化感作用分离纯化提取

程佳 王发啟 李小双 杜亚东 谢越

摘要:酚酸类物质是导致作物产生连作障碍问题的重要原因之一。对连作土壤中酚酸类物质进行有效提取和快速检测,是酚酸类物质研究的重要前提,也是农业行业和产业的技术需求。对酚酸类化感物质的种类结构、提取工艺、分离纯化和检测手段4个方面进行梳理总结,并对酚酸类物质的研究进行展望,以期为土壤中酚酸类物质的科学研究提供理论和技术参考,为缓解因酚酸类化感物质产生的土壤连作障碍问题提供新的思路。

关键词:化感作用;酚酸类物质;提取;分离纯化;定性定量分析

中图分类号: S184;S344.4  文献标志码: A

文章编号:1002-1302(2022)06-0008-08

收稿日期:2021-05-14

基金项目:安徽省自然科学基金(编号:2008085MC81);安徽省重点研发计划面上项目(编号:201904a06020042);企业横向委托项目(编号:2020QX001)。

作者简介:程 佳(1997—),女,安徽歙县人,硕士研究生,主要从事农业资源高效利用研究。E-mail:chengj8067@163.com。

通信作者:謝 越,博士,教授,硕士生导师,主要从事环境污染控制研究。E-mail:yorke@126.com。

化感作用是由Molish在1937年首次提出[1],后来国际化感作用学会将其定义为植物在生长发育过程中,将自身次生代谢的化学物质释放到周围环境,改变周围微生态环境,影响自身或周围其他植物的生长发育,导致植物间相互排斥或促进的现象[2-3]。众多研究表明,酚酸类物质为植物微生态环境中被鉴定最多、活性最强的一类化感物质[4-5]。国内外研究发现酚酸类化感物质释放到环境中有4种途径,即植物被雨水淋洗、植物残体分解(如凋落物)、根系渗出和挥发[6-7]。研究发现,这类化感物质是导致植物连作障碍的一个重要原因,在连作土壤中检测出的酚酸类物质含量明显增加。例如:在连作绥阳小米辣根际土壤中发现酚酸类物质数量从最初的1种增长到10种,其质量分数增加44.8%[8]。连作3年的甜瓜土壤与未连作的土壤比较,土壤中7种酚酸总含量显著增加,连作3年后干土中7种酚酸的总量较未连作土壤增加了96.80%[9]。

目前,酚酸类物质能够通过多种检测手段进行定性定量研究[10-13],但是这些方法均较为繁琐且检测条件有限,检测灵敏度较低,不适合连作田间土壤中酚酸物质的快速分析,因此,探究土壤样品中酚酸的前处理和酚酸类物质高灵敏、简便、快捷的检测方法已成为农业行业和产业普遍亟待解决的问题。本文综合国内外相关文献,从酚酸类物质的种类结构、提取分离纯化、检测方法及定性定量检测方面进行了归纳总结,以期为酚酸类物质引起的连作障碍问题的缓解提供技术参考。

1 酚酸类物质种类及结构特征

酚酸类化合物是一类结构简单、含有芳香酚环、酚羟基和羧基的有机酸。具有化感作用的酚酸类物质主要是苯甲酸为母核的C6-C1型酚酸和以苯丙烯酸为母核的C6-C3型酚酸。

1.1 以苯甲酸为母核的C6-C1型酚酸

具有化感作用的酚酸类化合物中,大部分属于母核为C6-C1型的苯甲酸类酚酸。目前研究显示,具有化感作用的物质主要有苯甲酸、对羟基苯甲酸、没食子酸、水杨酸、丁香酸、香草酸、原儿茶酸、龙胆酸等[10,14-15],其分子式和化学结构式详见表1、图1。

在药用植物连作障碍的研究中发现,没食子酸、水杨酸、丁香酸、香草酸、原儿茶酸等是导致三七、地黄、西洋参、人参、太子参、丹参、半夏等这些常用大宗道地药材产生化感作用的主要酚酸物质[16]。梁薇薇等通过室内模拟试验,阐明了苯甲酸、丁香酸及香草酸对红松种子萌发存在抑制作用,且对种子萌发的抑制作用强于对胚轴及胚根长的影响[14]。谢越等在研究5种酚酸对滁菊扦插幼苗的生长影响时,发现对羟基苯甲酸、水杨酸等苯甲酸类外源酚酸对根长度、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、叶绿素a含量、叶绿素b含量均有显著抑制作用,其中对羟基苯甲酸的抑制作用最强[17]。鲁晓峰等研究发现,对羟基苯甲酸与邻苯二甲酸2种酚酸能显著影响植株根系H+-ATPase、K+/Na+-ATPase及Ca2+/Mg2+-ATPase活性,阻碍细胞内外各离子的运转能力[18]。

1.2 以苯丙烯酸为母核的C6-C3型酚酸

以苯丙烯酸为母核的C6-C3型酚酸是具有化感作用的酚酸类化合物另一类主要构型,主要以肉桂酸及其衍生物的形式存在。目前研究表明,具有化感作用的的苯丙烯酸类化合物包括肉桂酸、对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸、2-甲氧基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、绿原酸等[10,15,19],其分子式和化学结构式详见表2、图2。

研究发现,低浓度的香豆素会对种子的萌发与生长产生很强的抑制作用,绿原酸对植物细胞壁的建立与根的生成则具有胁迫作用 [20]。Abenavoli等研究表明,反式肉桂酸、对香豆酸、阿魏酸不同程度地抑制了玉米幼苗对硝酸盐的吸收,影响了植物体内氮素营养情况,其抑制程度与酚酸浓度和其芳香环中取代基的结构有关[21]。

2 酚酸类物质提取

酚酸类物质酚羟基是其主要活性基团,但该基团容易受到光照、温度等外界因素的影响,大多易被氧化成羰基而失去活性[22]。因此,在酚酸的提取中须要注意光照、试验温度、试验时间等试验条件的影响。

2.1 溶剂提取法

酚酸类物质在植物中通常以氢键和疏水键形式与其他大分子物质形成稳定的分子复合物,所以对提取溶剂要求是对酚酸具有很好的溶解性,但不应与酚酸发生化学反应;有氢键断裂的作用,但浸出杂质少[23-24]。

常规溶剂提取法操作简单、成本低廉,不需要昂贵精密的仪器就能达到提取效果,被实验室作为最为常用的提取方法。杨泽良等通过应用不同提取溶剂提取细叶旱芹地上部化感物质,用其提取液处理蔬菜种子,发现乙醇提取液对蔬菜种子的萌发抑制效果最强,其次是甲醇提取物[25]。

除了常规的溶剂提取法,研究者还发现了新型绿色溶剂,在保证化合物高提取率的前提下,增加了环保、可持续性等功能。Alaón等提出了以氯化胆碱衍生物为基础的深共晶溶剂作为橄榄叶中酚类化合物的新型绿色替代溶剂,其提取率与传统溶剂相似[26]。深共晶溶剂具有热稳定性好、毒性低、可持续性、减少有机溶剂的使用和制备廉价等优点,被称为“21世纪的新型绿色溶剂”[27-28]。

2.2 超声波辅助提取法

超声辅助提取法提取样品中的有效成分是利用超声波具有的机械效应、空化效应和热效应作用,增大孔径从而加速化合物的扩散[29],超声波辅助提取条件有温度、溶剂、提取时间及料液比例等[30]。

超声波辅助提取法作为一种快速提取技术,能在短时间内提取高酚类、黄酮类和糖苷类化合物,减少溶剂消耗[31]。薛宏坤等提取万寿菊花多酚成分,采用二阶速率模型评价热回流提取法、超声波辅助提取法和微波辅助提取法3种提取方法,结果得出超声波辅助提取的总酚含量高于其他2种提取方法[32]。有学者研究超声辅助提取枸杞中绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸和阿魏酸等5种酚酸,采用4因素3水平Box-Behnken设计探讨出最优提取方法,即在33%的乙醇溶液 ∶样品体积比为 40 ∶1 的比例下,采用100 W超声功率,提取30 min,有利于酚类化合物的提取、分离和药物分析,为枸杞作为保健食品和药物的进一步研究奠定了基础[33]。

2.3 微波辅助提取法

微波辅助提取是采用非接触式热源,能量传递更快,可选择性加热减少热梯度,快速达到反应过程,使提取时间缩短、减少溶剂消耗[34]。

微波辅助提取法与超声波辅助提取法和溶剂提取法相比,该方法可以避免酚酸类物质的降解,同时在较短的时间内获得了所有组分的最高回收率,消耗的溶剂和能量更少[35]。Chiremba等用微波辅助提取不同硬度高粱和玉米麸皮和面粉中的结合酚酸,避免了咖啡酸随pH值的增加发生的不可逆的化学转化,同时也减少了羟基肉桂酸和羟基苯甲酸衍生物因高温产生的降解[36]。Pellati等在提取蜂胶原料中的酚酸类物质时,其回收率为95.3%~98.1%,并且没有降解产物生成[37]。Molina等比较不同方法提取酚酸和黄酮类化合物,结果表明,微波辅助提取的含量分别比索氏提取法和超声波提取法高34.54%、31.95%。利用微波提取的方法比其他方法提取时间短得多,是一种不需要有机溶剂就能获得酚酸类化合物的有效方法[38]。

3 酚酸类物质分离纯化

3.1 大孔树脂分离纯化

大孔吸附树脂的吸附性能与其表面性能、孔结构以及吸附剂的溶解度有关[39]。钟方丽等研究 D-101、LX-28、LX-1、LSA-21、LX-36、AB-8这6种不同类型大孔树脂对覆盆子总酚酸的静态吸附及解吸附效率,结果得出,AB-8型大孔树脂效果最好,吸附率达到89.56%,解吸率为90.69%,通过正交试验调整最佳纯化条件,其提取干浸膏中总酚酸含量提高为原来的3.5倍[40];这与刘兴赋等得出的结果[41]类似,AB-8分离蜘蛛香中总酚酸的效果最好,吸附率为92.93%,解吸率为84.24%。谢越等利用D-101大孔树脂柱富集纯化连作5年滁菊土壤样品中的阿魏酸,得到的100份校正样品经过近红外光谱法测定,其校正相关系数达到 0.991 4[11]。

3.2 萃取分离纯化

土壤中酚酸含量低,须要进行富集纯化,与其他物质分离,常用于富集酚酸的技术有液-液萃取[30]、固相萃取[42]、膜萃取[43]等。

有研究表明,在液-液萃取过程中进行强烈的振动,将极性相似的化合物转移到有机相中进行分离,正己烷和三氯甲烷馏分可以提取相对非极性的化合物,乙酸乙酯和丙酮可以提取相对极性的化合物,其余高极性的化合物则作为残留物留在水相中[30]。固相萃取的效果由固相萃取柱的组成以及吸附、解吸原理决定,张晓华等用HLB、PSD和MAX这3种不同的固相萃取柱对模拟蜂蜜中酚酸类物质检测进行前处理,结果表明,经HLB柱处理的10种酚酸类物质的平均回收率为70.9%~102.2%;经PSD柱处理的平均回收率为55.7%~85.5%;经MAX柱处理的平均回收率为1.8%~102.1%,表明不同的萃取柱组成导致的萃取效果不同[42]。

含极性或者极性较强的酸性有机物在高效气相色谱或高效气相色谱-质谱联用检测前须要进行衍生化才能实现,张莉等检测水中酚酸采用聚苯乙烯-二乙烯苯膜萃取,萃取完成后,将膜片移入衍生瓶中,采用超声技术对酸性有机物进行洗脱和衍生,可以有效节省溶剂的使用和预处理时间[44]。Asadi等采用凝胶电膜法利用电辅助有效提取苹果、橘子和猕猴桃汁中酚酸类化合物,以最佳参数对提取方法进行了验证,得出较高的线性及回收率[43],具有操作简便、成本低、环境友好等优点。

4 酚酸类物质的检测方法

4.1 福林酚(Folin-Ciocalteu)比色法

福林酚比色法多酚含量测定的原理为在碱性条件下,酚类化合物的酚羟基与Folin-Ciocalteu试剂中钨钼酸的W6+反應,将其还原成W5+,生成蓝色络合物[45],在一定波长范围内可测定其吸收度。

福林酚比色法适合较为简单的总酚测定,可以准确稳定测出总酚含量,林倩等采用响应面法优化福林酚法测定冬枣中总酚含量,优化后Folin-Ciocalteu试剂浓度为0.8 mol/L、20%碳酸钠溶液取0.6 mL、反应温度为40 ℃,测得的总酚含量与预估值吻合度达98.4%[46]。但是福林酚比色法会受到其他氧化物质的干扰,对酚类物质不具有特异性,在较复杂的植物样品的测定前需要注意其他易氧化物质的干扰[47]。Padda等测定甘薯总酚时比较Folin-Denis、Folin-Ciocalteu 2种试剂测出的总酚含量,发现Folin-Ciocalteu试剂受还原糖及抗坏血酸等其他易氧化物质的干扰更大,导致Folin-Ciocalteu试剂测出的总酚含量偏高[48]。这与Showkat等在研究菊芋酚酸时的结论一致,福林酚比色法测出的总酚含量偏高[49]。

4.2 高效液相色谱(HPLC)法

利用高效液相色谱研究土壤中的化感自毒物质酚酸类物质文献报道很多。大部分文献报道中色谱柱采用十八烷基键合硅胶色谱柱,流动相体系均为有机相——水,调节pH值使流动相体系成弱酸性,减少了苯酚、酚羟基和羧基的电离[50],有利于酚酸物质的分离。谢越等选用Symmetry C18色谱柱同时测定滁菊样品中的9种酚酸,色谱条件为流动相A为乙腈,流动相B为以冰醋酸调节至pH值为2.8的0.02 mol/L磷酸盐缓冲溶液,柱温设为 25 ℃,在280 nm检测波长下运行30 min,结果表明,其检出限介于0.01~0.08 mg/L,达到痕量检测要求[10]。González-González等建立了高选择性、高灵敏度、高精确度的高效液相色谱-二极管阵列检测器同时测定龙葵水提物及其水解产物中6种酚酸的含量,该方法在浓度范围内呈良好的线性关系(r>0.999),回收率为88.07%~109.17%,基质效应均小于5%,可作为药用植物提取液的检测[51]。Nian等则利用HPLC快速、高准确度等特点在 30 min 内检测出茶叶中20种化合物,其中包括酚酸类化合物[52]。

现在对高效液相色谱法检测酚酸物质的方法越来越成熟,越来越多研究者们结合其他方法或条件,使检测结果更加准确。比如,超高压液相色谱法与小粒径色谱柱结合,可以达到高效、快速的分离目的,中药虎杖中的34种化合物可以在10 min内分析完成[53]。还有结合数学方法,利用数字色谱结合普通色谱或质谱的方法将重叠难区分的谱图分辨为纯物质的谱图,从而实现化合物的快速检测,比如利用高效液相色谱法结合交替三线性分解算法(ATLD),可实现蜂蜜中10种酚酸类物质快速定性和定量分析[42]。

4.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法具有分辨率高、模式多、分析时间短、操作成本低、污染物去除容易等优点,可以高效地进行提取物的分离与测定[54]。Martí 等通过响应面法优化在20 min内实现了番茄中9种多酚的分离,经过方法验证,该方法回收率为77%~106%,日内、日间的峰面积相对标准偏差分别<3.1%、<3.7%,保留时间的相对标准偏差分别<0.2%、<1.4%,检出限浓度为0.8~3.8 mg/kg,满足了毛细管电泳法分析番茄中多酚类物质的要求[12]。

电动增压毛细管电泳是瞬间等速电泳和场放大进样结合的在线富集方法,可同时分析植物中常见的10种酚酸,该方法验证结果表明,回归曲线的相关系数大于0.997,相对标准偏差和相对误差分别小于9.63%、4.70%,检出限(LOD)为0.01~2.5 ng/mL,与传统的毛细管区带电泳方法相比,该方法对酚酸的灵敏度可提高2.5万倍[55]。毛细管电泳-化学发光法可以快速分离并定量检测出中药中阿魏酸、绿原酸、水杨酸这3种酚酸类物质,在优化条件下,可在7 min内达到化合物的分离并快速检测[56]。毛细管电泳法是一种比HPLC法样品消耗量和溶剂消耗量低的绿色方法,符合环境友好的环保要求。

4.4 红外吸收光谱法

近年来,红外吸收光谱法作为一种快速检测分析的方法,而且可以对化合物基团进行准确鉴别,逐渐进入研究者的视野。红外吸收光谱法测出各物质的数据较复杂,可能出现非线性关系且含量差异大,因此需要结合化学计量学对复杂的数据进行统计分析,偏最小二乘法就是常用的与红外吸收光谱结合的常用方法[57]。偏最小二乘傅里叶变换红外光谱法测定药用植物提取物中酚酸含量,测得的酚酸含量与Folin-Ciocalteu比色法测得的酚酸含量在相同范围内,通过不同波段比较,其中红外法测得的结果最为准确[58]。谢越等快速检测连作土壤中阿魏酸含量,测出数据采用偏最小二乘法分析,结果表明,模型校正集和验证集与高效液相色谱法测定的参考值之间均呈现良好的相关关系,校正相关系数与交叉验证相关系数均大于0.99[11]。Vivar-Quintana等利用近红外光谱法测定蜂胶中的酚酸物质,得出结果[59]也与高效液相色谱法一致。

也有学者认为近红外光谱法需要通过数学模型进行二次拟合,才能得到被测化合物的含量,其准确度不足以取代传统的高效液相色谱法,且建立近红外光谱的识别和定量模型需要大量的时间、成本和精力,但模型建立后,近红外光谱具有非破坏性和测量时间短(约5 min)的巨大优势[60]。近红外光谱作为一种快速、无损的方法,在不使用试剂的情况下,制备样品较少或不需要制备样品,是未来酚酸类检测的可行性方法。

4.5 超高效液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)

超高效液相色谱在高效液相色谱的基础上对分离效果和灵敏度进一步提高[61-62],但是对分离化学分子质量、结构相近的化合物以及含量较低的游离酚酸分离效果和灵敏度还存在不足[63]。Fang等采用UPLC-MS对全国各地的金莲花汤剂中化学成分进行鉴定,共鉴定出89种化合物,除个别化合物外,其他化合物的精密度、重复性、稳定性和回收率均符合测定要求,定量限低至0.05~4.67 ng/mL[64],可用于中藥制剂痕量成分的相关研究。

优化色谱柱、流动相组成和流速等色谱条件,使相邻峰得到最佳分离,避免了峰拖尾,可以得到更好的检测结果。Wabaidur等优化UPLC-MS建立了一种简便、灵敏、准确的UPLC-MS方法,用于蜂蜜中9种酚酸类、9种黄酮类、4种酚类物质的同时分离、鉴定和定量[13]。对于复杂的样品,UPLC与MS联用可以同时对多种酚酸类物质在较短的时间里进行定性与定量分析,具有高选择性与高灵敏度,可节约试验时间以及试验能源,UPLC-MS越来越被科研工作者青睐。

5 展望

酚酸类物质已经被证明是单一体系连作的重要化感物质。然而,其产生机制尚不完全明确,与植物生长的相互作用还需要深入研究,进行这些科学研究工作的前提是酚酸类物质从土壤环境中有效分离和快速分析,这对于快速发展的现代农业行业和产业来说,是急迫的技术需求。

另外,有研究發现酚酸物质在田间土壤中的浓度,明显低于实验室试验抑制种子发芽和幼苗生长的浓度,田间条件下酚酸自毒的作用是如何发挥的?各种酚酸结构中的不同官能团,是否在化感自毒过程中扮演不同作用?酚酸类物质性质不稳定,其酚羟基在光照、温度等自然环境下会造成氧化失活,发生降解等反应,因此,温室效应下气温升高与二氧化碳浓度升高是否会对酚酸类物质产生和降解产生影响?在农田自然条件下可以采取哪些措施,促进酚酸类物质降解?这些科学问题关系到田间土壤体系中酚酸物质自毒机理,以及能否通过改变环境因素,改变酚酸形态,降低酚酸浓度,甚至在田间土壤环境中,原位降解酚酸,减少酚酸类物质的自毒效应,从而缓解作物的连作障碍问题。上述这些问题关系到农业的绿色高质量发展,都值得进一步深入研究。

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