伍麦尔·麦海提，古力拜克然木·阿吾提

（1.新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆阿拉尔 843300；2.阿克苏地区动物疫病控制诊断中心，新疆阿克苏 843000；3.阿克苏地区动物卫生监督所，新疆阿克苏 843000）

盐穗木（Halostachys caspica）是黎科（Chenopodi⁃aceae）盐穗属（HalostachysC.A.Mey）植物［1］，分布于吐鲁番的托克逊、南疆的塔克拉玛干沙漠（英吉沙、阿克苏、和田）及其周边荒漠地区［2］，生长在荒漠及半荒漠的沙漠地、盐碱地、湖泊等。盐穗木对盐碱地有较好的耐受性，具有耐盐、耐碱、耐干旱、沙埋、抗风等特点［3］。盐穗木常应用于荒漠、半荒漠地区的防沙固土、控制沙尘暴、改善环境条件［4］等。

南疆地区气候干燥，生态脆弱，沙漠化和盐碱化很严重。饲料资源短缺阻碍了当地畜牧业的发展，盐穗木的饲料作用在一定程度解决了这个困难。粗饲料是草食家畜饲料中直接影响动物生长和生产性能的组成成分。盐穗木具有较大的饲料和药物价值，含有可溶性盐分、灰分、粗蛋白，能满足家畜动物的营养需求，用盐穗木饲喂卡拉库尔羊，能显著增加其体重［5］。

金黄色葡萄球菌（S.aureus）是典型的革兰氏阳性病原体，广泛分布于自然界［6］。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属成员之一，最早是在一位病人溃疡的脓疮中发现，其引起的疾病表现出高发病率及高死亡率，金黄色葡萄球菌所带来的危害仅次于大肠埃希菌（E.coli）［7］。它可引起多种人类疾病，如骨髓炎、心内膜炎、毛囊炎、败血症、坏死性肺炎、脓毒血症等全身性感染，甚至机体死亡［8］。抗生素耐药性引起金黄色葡萄球菌耐药性经常发生，在抗菌谱分析中，盐穗木提取物对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌抑菌作用明显［9］，盐穗木的乙酸乙酯、正丁醇提取物具有明显的抗菌活性。

研究盐穗木正丁醇萃取物单体对金黄色葡萄球菌细胞壁结构完整性的影响，有助于揭示盐穗木的抑菌机理。盐穗木的研究领域涉及生态学、药物化学及抑菌作用等方面，抑菌机理研究较少，为解决细菌耐药性，试验研究了盐穗木正丁醇萃取物的抑菌机理，对促进南疆经济发展具有实际意义［10］，为合理开发盐穗木饲料及新植物资源和新兽药的研发奠定基础。

金黄色葡萄球菌是人类和家畜感染的主要致病菌之一［11］。细菌耐药性已成为临床医药上比较棘手的问题，所以，用于治疗金黄色葡萄球菌感染的新型药物缺乏问题急待解决。前期试验选择了多种植物进行抑菌试验，结果表明，盐穗木对金黄色葡萄球菌抑菌效果明显，抑菌效果强于黄连素，对大肠杆菌也有明显的抑菌作用。故以盐穗木为研究材料，分离活性单体，筛选抑菌有效成分，测定其抑菌谱和抑菌效价，为盐穗木的综合利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料

新疆阿拉尔市周边地区采集盐穗木，采用随机取样法取地面部分的茎、叶或子实等，自然阴干，粉碎备用。

1.2 试剂

甲醇、无水乙醇、氯仿、75%乙醇、正丁醇、氢氧化钠、乙酸乙酯、蒸馏水、盐酸、柱层析硅胶，其他试剂为常规分析纯试剂。

1.3 仪器

N-1300D-WB 型旋转蒸发仪；KQ-500DE 型高功率数控超声波清洗仪；紫外分光光度计；气相-质谱联用仪；SW-CJ-2FD 超净工作台（BAOXUN）；电子天平（梅特勒托利多有限公司）；高压灭菌锅（HI⁃RAYAMA）；THZ-82A 水平摇床（金坛市医疗仪器厂）；DHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱；HPX-9052MBE 数显电热培养箱；HH-S4 数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）；SHZ-D（III）循环水式多用真空泵；高速万能粉碎机；恒温培养振荡器。

1.4 培养基

1.4.1 固体培养基 Mueller-Hinton 琼脂（g/L）：牛肉浸粉6.0，可溶性淀粉1.5，酸水解酪蛋白17.5，琼脂17.0，pH 7.3±0.1，冷却至25 ℃。

1.4.2 盐穗木培养基 称盐穗木粉末42.0 g，加热后溶解于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，待冷至50 ℃时，倾入无菌平皿，备用。

1.5 方法

1.5.1 正丁醇萃取物的提取 自然风干的盐穗木用中药粉碎机（型号FW177，粉碎目数60～200 目，转速24 000 r/min）粉碎，取盐穗木粉碎样品400 g 于广口瓶中。加入75%的乙醇浸泡6～7 h，后用KQ-500DE 型超声波清洗器处理60 min（水温38～40 ℃，水位92 mm，功率100%），趁热抽滤，收集滤液，蒸出的乙醇浸泡过滤留下的盐穗木，减压回收得乙醇浸膏提取物。乙醇浸膏加适量2%盐水搅拌溶解，过滤除去难溶性物质，再加NaOH 调节pH 9~10（碱性），过滤于分液漏斗，加上500 mL 氯仿，混匀静置分层（一般15～20 min），分层液体的上面是蒸馏水，下面是氯仿液，将氯仿液倒入旋转蒸发仪蒸发（60 ℃），回收氯仿进行萃取，至氯仿萃取液无色即为氯仿萃取物。依次加入氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取。

1.5.2 正丁醇萃取物单体的提取 取适量正丁醇萃取物于蒸发皿并加5 mL 甲醇溶解，然后加10 g 硅胶混匀完全溶解，置于恒温水浴锅上至完全烘干得到正丁醇萃取物硅胶颗粒。硅胶用洗脱机充分溶解装柱至层析柱的2/3。洗脱剂用甲醇、氯仿、乙酸乙酯以1∶2∶1 比例配置。干法上样，锥形瓶接出滤液，控制洗脱剂的流速，不宜太快，控制在5 mL/min，收集萃取液，直至无色为止，每瓶100 mL，滤液减压回收编号待用。收集萃取液用小型旋转蒸发仪蒸发，将各个收集液浓缩至5 mL 小瓶中，蒸干后的物质备用。各个萃取物按此方法重复多次，即可得到正丁醇萃取物的单体。

1.5.3 正丁醇萃取物单体MBC 和MIC 的测定 取盐穗木的正丁醇萃取物单体，用蒸馏水溶解膏体，配成250 mg/mL 的正丁醇萃取物溶液。用倍比稀释法制成250 、125、62.5 、31.25 、15.6 、7.8、0 mg/mL。分别吸取1 mL 至7 支试管中，分别加入970 μL 培养液和30 μL 106CFU/mLS.aureus菌液，使1～7 号试管中药液的终浓度分别为125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、0 mg/mL。于37 ℃恒温培养箱中培养16~24 h，均匀涂布接种于固体培养基上，培养16～24 h后观察结果。以菌落数出现最少的最大萃取物浓度为最低抑菌浓度（MIC），以无菌落生长的最小萃取物浓度为最低杀菌浓度（MBC）［12］。

1.5.4 纸片法评价正丁醇萃取物单体的抑菌效果盐穗木单体药物浓度为125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、0 mg/mL，采用纸片法做药敏试验。根据抑菌圈直径的大小来判断S.aureus对药液敏感程度，判断标准如下［13，14］。抑菌圈直径≥20 mm 为极敏；15 mm≤抑菌圈直径<20 mm 为高敏；10 mm≤抑菌圈直径＜15 mm 为中敏；5 mm≤抑菌圈直径＜10 mm 为低敏；抑菌圈直径＜5 mm 表示呈耐药，无抑菌效果。

1.5.5 正丁醇萃取物单体的结构鉴定 GC-MS 色谱柱AB-5MS 5% Phe-nyL-95% Dimethylpolysilox⁃ane。（30 m×0.25 mm×0.25 mm）弹性毛细管柱；柱温60 ℃，10.5 ℃/min 升温至300 ℃，保留5 min；汽化差温度250 ℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压52.54 kPa、载气洗量1.0 mL/min；分流比20∶1，溶剂延迟3 min。

离子源为EI 源，离子源230 ℃，四级杆150 ℃，电子能量70 eV，发射电源流34.6 μA；倍增器电压1 125 V；接口温度280 ℃；质量范围20～450 amu。

Nist2005 和Wiley275 谱序检查。

2 结果与分析

2.1 正丁醇萃取物的抑菌效果

如表1 所示，1 号、2 号、3 号纸片法药敏试验的抑菌圈直径分别为18.0、15.4、14.3 mm，敏感度分别为高敏、高敏、中敏，4 号为低敏。

表1 纸片法评价正丁醇萃取物单体抑菌效果

2.2 正丁醇萃取物单体的MIC 和MBC

如表2 所示，盐穗木正丁醇萃取物单体具有显著的抑菌特性，随着单体药物浓度增大，抑菌圈也越来越大，表明抑菌效果更好。5~7 号培养基细菌生长较好，金黄色葡萄球菌对该浓度表现为耐药性。4号培养基有少数金黄色葡萄球菌，1~3 号培养基均无金黄色葡萄球菌生长。4 号为菌落数出现最少的最大萃取物浓度，为最低抑菌浓度（MIC），为15.60 mg/mL。3 号为无菌落生长的最小萃取物浓度，为最低杀菌浓度（MBC），为31.25 mg/mL。

表2 正丁醇萃取物单体的抑菌效果

2.3 盐穗木正丁醇萃取物单体结构

经鉴定，盐穗木正丁醇萃取物单体为N-氰基-乙基苯磺酰胺（N-（2-Cyano-ethyl）-benzenesulfon⁃amide），分子式为C9H10N2O2S，结构式如图1 所示。

图1 盐穗木正丁醇萃取物单体结构式

3 小结

盐穗木正丁醇生物碱萃取物成分种类较多，其抑菌性差别较大。本试验旨在摸索盐穗木正丁醇生物碱抑菌效果最好的单体成分。前期试验表明，盐穗木的提取条件、萃取条件均会影响单体成分的产量，因单体成分总重量少，在试验过程中存在较大的偶然误差。

盐穗木正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用，主要抑菌物质是N-氰基-乙基苯磺酰胺，其最低抑菌浓度15.60 mg/mL，最小杀菌浓度31.25 mg/mL。