周连玉， 焦 璐， 巨家升， 蒋 霞， 罗巧玉，2，4， 马学兰

(1.青海师范大学 生命科学学院，青海 西宁 810008;2.青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁 810008；3.青海省青藏高原生物多样性形成机制与综合利用重点实验室，青海 西宁 810008;4.高原科学与可持续发展研究院，青海 西宁 810008)

Epichlo⊇属(其无性系以前称为Neotyphodium属)属于禾草内生真菌，在植株体内系活体营养，其与宿主植物形成一种互利共生的关系，可为宿主带来多种有益性能[1]；而在体外培养时菌丝生长比较缓慢[2]，不同菌株生物学特性具有一定差异[3-4]。中华羊茅 (Festucasinensis) 隶属早熟禾族(Poeae)羊茅属(Festuca)，是一种内生真菌侵染率高的多年生草本植物，从植株不同组织中分离出多种内生真菌菌株，对菌株的生物学与生理学特性、生物活性、形态多样性及分类学地位进行了研究[5-8]。矿质元素是生物生长代谢相关酶的重要成分之一，一些研究已证实矿质元素影响着真菌菌体生长以及对营养物质的吸收[9-10]，而合适的矿质元素种类以及浓度梯度能促进菌丝体生长、提高一些矿质元素或其他成分的含量[11-12]。硒是人体和动物必需矿质元素之一，具有提高免疫力、抗癌、抗氧化等多种功能[13]。许多真菌能富集硒并将无机态硒转化为菌体中有机态硒[14-16]。硒对真菌的研究主要集中在生长特性、形态变化、抗氧化活性、硒代谢以及化学组分等方面[14-20]。当培养液中添加不同浓度硒化合物时，真菌在生长过程中菌丝体或发酵液的营养成分会发生一系列的变化[21-24]，而适宜的硒浓度能明显提高某一特定的营养物质含量。廖日权等[25]以富硒总量为指标，对内生真菌富硒培养条件进行了优化。有关内生真菌体外培养菌丝体积累其他矿质元素的研究目前报道还较少。本研究基于前期对中华羊茅内生真菌菌株Epichlo⊇ sp.生物活性的研究，通过液体培养中华羊茅内生真菌，初步探讨在不同亚硒酸钠浓度条件下，菌丝体生长和矿质营养吸收的动态变化，旨在为理解内生真菌富硒特性，进而为进一步开发利用植物富硒内生真菌资源，利用内生真菌改良牧草品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 中华羊茅内生真菌菌株保存于青海师范大学微生物实验室。

1.1.2 培养基 ①PDA培养基；②液体菌种培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 自然；③发酵培养基：蔗糖 30.0 g，酵母膏 2.5 g，蛋白胨 1.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 自然。

1.1.3 试剂与仪器 盐酸和硝酸为优级纯，氢氧化钾、硼氢化钾、铁氰化钾、过氧化氢、盐酸羟胺等试剂为分析纯。立式压力蒸汽灭菌锅(LS-35HD，江阴滨江医疗设备有限公司)；生化培养箱(250B，金坛市富华仪器有限公司)；超净工作台(CJ-1S，天津市泰斯特仪器有限公司)；可见分光光度仪(V-5100，金坛市富华仪器有限公司)；水浴恒温振荡器(SHA-C，金坛市天竟实验仪器厂)；离心机(TD5A，湖南赫西仪器装备有限公司)；微波消解仪(MD8H，奥谱勒仪器有限公司)；原子荧光光度仪(AFS-933，北京吉天仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制备液体菌种 250 mL三角瓶中装入100 mL液体菌种培养基，接入直径4 mm中华羊茅内生真菌菌块3块，25 ℃，130 r/min振荡培养15 d，所得发酵液即为液体菌种。

1.2.2 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养的影响 分别配制含0(CK)、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L亚硒酸钠的发酵培养基，并将95 mL培养基装入250 mL三角瓶，接种5 mL液体菌种，25 ℃培养，分别于4、5、6、7、8周收集发酵液，4 000 r/min离心收集菌丝体和上清液，菌丝体经蒸馏水洗涤3次，60 ℃烘干后称干质量。

1.2.3 测定指标 菌丝体样品中加入消解液，经微波消解后的消化液采用钼蓝比色法[26]、四苯硼钠法[27]、偶氮氯膦III法[28]、邻菲啰啉比色法[26]，分别测定磷、钾、钙、铁的含量，采用GB5009.93-2017(第一法氢化物原子荧光光谱法)测定硒含量[29]。

1.2.4 统计分析 试验数据结果均采用平均值±标准误表示，各项指标釆用SPSS16.0统计分析软件进行单因素方差分析(LSD，P<0.05)。采用Spearman双侧检验矿质元素之间的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体干质量的影响

由表1可知，培养时间和亚硒酸钠浓度显著或极显著影响着中华羊茅内生真菌菌丝体干物质。当培养时间相同时，对照组菌丝体干物质显著高于加亚硒酸钠组(P<0.05)，且随着亚硒酸钠浓度的增加菌丝体干物质逐渐减少(表2)。当培养4～8周时，不加亚硒酸钠或亚硒酸钠浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L条件下，一般5～6周时菌丝体干物质达到最大值，随着培养时间的继续延长菌丝体干物质出现减少趋势。

表1 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体干物质和矿质元素影响的方差分析

表2 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体干物质的影响

2.2 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体磷含量的影响

亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌菌丝体磷含量的影响达到显著(P<0.05)或高度显著水平(P<0.001)(表1)。表3结果表明：当亚硒酸钠浓度为0.1、0.2、0.4 mmol/L时，菌丝体磷含量均于第6周达到最大值，其含量显著高于其他培养时间(P<0.05)。当亚硒酸钠浓度为0.3 mmol/L时，培养第4周的菌丝体磷含量明显低于其他培养时间(P<0.05)。但不加亚硒酸钠时，菌丝体磷含量于第4周、第5周达到最高值。当培养4～8周时，添加亚硒酸钠组菌丝体磷含量显著高于对照组(P<0.05)。

表3 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体磷含量的影响

2.3 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体钾含量的影响

不添加亚硒酸钠时，菌丝体钾含量在不同培养时间差异不显著；而在其他情况下差异显著(P<0.05)，或高度显著性差异(P<0.001)(表1)。当亚硒酸钠浓度为0.1、0.2、0.4 mmol/L时，培养第6周的菌丝体钾含量显著高于培养时间为4周、5周、7周和8周(P<0.05)(表4)。当亚硒酸钠浓度为0.3 mmol/L时，培养第5周的菌丝体钾含量达到最大值；而不加亚硒酸钠时，培养4周的菌丝体钾含量最低。当培养4～8周时，添加亚硒酸钠组菌丝体钾含量均显著高于对照组(P<0.05)。

表4 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体钾含量的影响

2.4 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体钙含量的影响

培养时间和亚硒酸钠浓度对菌丝体钙含量的影响达到高度显著水平(P<0.001)(表1)。除添加亚硒酸钠浓度0.3 mmol/L的菌丝体于第7周钙含量为最高值外，亚硒酸钠浓度为0.1、0.2、0.4 mmol/L培养至第6周的菌丝体钙含量显著高于其他培养时间(P<0.05)(表5)。当培养时间为4周时，添加亚硒酸钠浓度0.3、0.4 mmol/L，菌丝体钙含量明显高于亚硒酸钠浓度为0、0.1、0.2 mmol/L的菌丝体(P<0.05)。

2.5 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体铁含量的影响

亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌菌丝体铁含量的影响见表1和表6。当不添加亚硒酸钠时，菌丝体铁含量在不同培养时间条件下不存在显著差异；而在其他情况下均存在差异显著或高度显著性差异(P<0.05，P<0.001)(表1)。除了添加亚硒酸钠浓度0.3 mmol/L的菌丝体于第4周铁含量达到最高值外，添加亚硒酸钠浓度为0.1、0.2、0.4 mmol/L的菌丝体均于培养第6周铁含量显著高于其他培养时间(P<0.05)(表6)。当培养液不添加亚硒酸钠时，菌丝体铁含量在不同培养时间不存在差异性。当培养4～8周时，对照组铁含量均显著低于添加亚硒酸钠组(P<0.05)。

表5 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体钙含量的影响

表6 亚硒酸钠浓度或培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体铁含量的影响

2.6 亚硒酸钠浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体硒含量的影响

培养时间和亚硒酸钠浓度对菌丝体硒含量的影响达到高度显著水平(P<0.001)。当培养时间相同时，对照组发酵液中硒含量显著低于添加亚硒酸钠组(P<0.05)。在亚硒酸钠浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L条件下，随着培养时间的延长菌丝体硒含量呈先升后降趋势(表7)。

表7 亚硒酸钠浓度或培养时间对中华羊茅内生真菌液体培养菌丝体硒含量的影响

2.7 矿质元素各组分之间的相关性分析

表8为菌丝体干物质、磷、钾、钙、铁和硒含量组分之间的相关性分析结果。除添加亚硒酸钠组磷含量和硒含量存在较强的相关性，达到显著水平(P<0.05)；磷、钾、钙、铁、硒含量两两之间均存在极显著的相关性(P<0.01)。对照组磷含量与硒含量之间的相关系数为0.932，达到极显著水平(P<0.01)。

表8 中华羊茅内生真菌菌丝体干物质和矿质元素之间的相关性分析

3 讨 论

不同营养成分以及不同浓度对真菌生长及矿质营养吸收作用有差异[30,18]，培养液中添加磷酸二氢钾明显地影响松乳菇菌丝体干物质以及磷、钾、镁、锰和锌的吸收，而对钙和铁的吸收无作用；0.5 g/L的磷酸二氢钾更能促进菌丝体生长和磷、钾、镁和锌的吸收[18]。王关林等[31]发现灵芝菌丝体富硒后，矿物质除铬外，钠、钙、铁、锌、硒和钼等11种元素均增加。与普通灵芝菌丝体相比，250 μg/mL亚硒酸钠增加灵芝菌丝体铝、镉、钡含量，降低钾、铜含量，而对铁、钙、硼、钠基本无影响[32]。亚硒酸钠对雅致放射毛霉液体培养菌丝体中常量元素、微量元素以及有毒元素的作用各异，2 μg/mL亚硒酸钠增加菌丝体钠、钾、钙、锌、硒、镉含量，降低菌丝体镁、锰、铜、钡、铅和锑的含量[33]。本研究发现添加0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L亚硒酸钠抑制中华羊茅内生真菌菌丝体的生长，而有利于菌丝体吸收矿质营养磷、钾、钙、铁和硒；当培养5～6周时,菌丝体干物质和矿质元素含量达到最大值(表2、3、4、5、6、7)，这表明菌丝生长旺盛时,从培养体系中吸收矿质元素的能力增强；在不同的亚硒酸钠浓度条件下，菌丝体干物质和矿质元素的减少或增加幅度不同，说明物质浓度对菌丝生长代谢有不同程度的影响；添加亚硒酸钠的菌丝体磷、钾、钙、铁、硒之间存在显著或极显著的正相关性(P<0.05，P<0.01)(表8)，这表明硒能促进中华羊茅内生真菌菌丝吸收磷、钾、钙、铁、硒等矿质元素。上述研究证实了不同菌株在不同亚硒酸钠浓度条件下菌丝体矿质元素变化不一致，矿质元素的吸收还与菌丝体生长状况有关。因此，在培养基中添加适宜及适量的矿质元素以提高菌丝体在生长过程富集一些有益的常量元素或微量元素，或者阻断菌体对一些有毒金属的富集。今后将进一步研究中华羊茅内生真菌富硒液体培养菌体形成的有机硒种类以及含量。

目前，为了充分发挥内生真菌的有益作用，构建植物-内生真菌共生体，林晗等[34]对千年桐幼苗接入不同内生真菌菌株，发现内生真菌菌株能提高植株地上部分磷和根系含量，接种盾壳霉属菌株、链格孢属菌株和木霉属菌株表现得更加明显；而镰刀菌属和生赤壳属菌株处理的植株根系钾含量高于叶片。中华羊茅内生真菌共生体对矿质营养物质的影响亟待进一步的研究。