张忠平,马政涛,张海月,丛 宇

（黑龙江省中医药科学院,黑龙江 哈尔滨 150036）

缺血性中风是一种临床高发疾病,康复时间窗较长,治疗有限。中风后体内免疫炎症变化是影响中风后康复转归的重要因素[1]。免疫细胞中辅助性T细胞（Th17）分泌促炎因子白细胞介素（IL）-17,参与早期炎性反应；调节性T细胞（Treg）则分泌抗炎因子IL-10等,减轻外周和脑组织的促炎因子,发挥抑制炎症的作用[2]。相关研究表明,中风大鼠脑组织Th17细胞增多,Treg细胞减少,表明脑梗死后大鼠脑组织中Th17/Treg的平衡被破坏,免疫炎性反应被激活[3]。Fox P3是调控Treg细胞的关键转录因子之一,表达部位主要为受损的病灶及周边区域,研究表明大鼠脑组织受损部位Fox P3的表达与脑组织受损的形成密切相关[4]。缺血性中风后肠固有层和上皮细胞的T细胞和肠道菌群可促使肠道免疫系统通过释放活性氧、氮及外肽酶等神经毒性因子,促进神经系统退行性变,在中风的病理生理中起至关重要的作用[5]。为阐明肠道免疫微生态在大脑中动脉阻塞（MCAO）模型大鼠治疗中的保护机制,本研究观察针灸干预对脑肠组织中的Fox P3和IL-17的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 本研究经黑龙江省中医药科学院动物专业委员会批准（H20201001）。SPF级雄性Wistar大鼠50只,购自哈尔滨医科大学动物实验中心[动物生产许可证编号:SCXK（黑）2019-001]。8周龄,平均体质量280 g。动物饲养于我院动物实验中心,按照实验动物饲养标准进行饲养。动物实验设施许可证编号:SYXK（黑）2016-008。

1.2 实验仪器 激光多普勒血流仪（瑞典帕瑞医学公司,型号PeriFlux 5000）；增强型小动物麻醉机（深圳瑞沃德生命科技公司,型号R540）；华佗牌电针治疗仪（苏州医疗用品有限公司,型号SDZ-V）；一次性无菌针灸针（0.25 mm×25 mm,贵州安迪药械有限公司）。

2 实验方法

2.1 实验分组 所有大鼠耳部标号,按照随机数字表法分为手法组、针刺组、电针组、空白组、手术组,每组10只。所有动物实验步骤均按照动物实验研究方案进行。

2.2 MCAO模型制备 用异氟烷麻醉针刺组、手法组、电针组、手术组大鼠,在其中线颈部切开1个切口,分离并结扎左颈总动脉和左颈外动脉,将1条2 mm长的鱼线插入左颈内动脉,并通过激光多普勒血流信号确认大脑中动脉闭塞,2 h后拔鱼线恢复灌注。空白组不执行任何操作。

2.3 干预方案

（1）针刺组 固定MCAO模型大鼠,选取百会、膈俞、脾俞、肾俞、后三里,穴位和针刺方法参照《实验针灸学》[6]。75%酒精棉球常规消毒,术者右手持针灸针,常规针刺,行捻转手法1 min,针下有紧滞感后,不做任何操作,留针15 min。每日1次,连续干预14 d。

（2）手法组 固定MCAO模型大鼠,选穴和消毒手法同针刺组。针刺后行捻转手法1 min,得气后,行搓针手法,至气满针摇为宜,留针15 min。每日1次,连续干预14 d。

（3）电针组 固定MCAO模型大鼠,选穴和消毒手法同针刺组。术者右手持针灸针,针刺后行捻转手法1 min,针下有紧滞感后,于同侧膈俞、肾俞接电针治疗仪,膈俞接正极,肾俞接负极,给予断续波,频率2/10 Hz,时间15 min。每日1次,连续干预14 d。

（4）手术组、空白组 每日固定大鼠,不做任何治疗,每次15 min。每日1次,连续干预14 d。

2.4 标本采集

（1）脑组织匀浆标本 干预14 d后,用小型动物麻醉机吸入异氟醚麻醉各组大鼠。在颅颈交界处用组织剪刀固定并切断大鼠颅骨,然后用剪刀将颅骨从枕孔处剪开至两侧眼眶,用弯钳夹起颅骨,将脑组织轻轻取出,剪断神经及附属组织,完整取出大脑组织。用冷盐水冲洗、滤纸擦拭、称重,取脑组织块50 mg,按质量、体积比1∶9的比例加入无菌磷酸盐缓冲（PBS）溶液,以15 000 r/min在组织破碎机上粉碎为10%的组织匀浆,然后以3 000 rpm离心15 min,取上清液,分开包装,－80℃保存。

（2）肠组织匀浆标本 切断大鼠颅骨后,立即解剖腹腔,剪取肠组织,用PBS缓冲液将粪便、血液等冲洗干净后,剪取1.5 cm肠组织,按脑组织匀浆标本的提取方法提取肠组织匀浆上清液,在－80℃条件下冷冻保存。

3 实验结果

3.1 实验指标 取适量上清液,采用酶联免疫吸附法检测肠组织、脑组织中FoxP3、IL-17含量。详细步骤按照试剂盒使用说明书。

3.2 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件处理数据。计量资料符合正态分布时,以均数±标准差（±s）表示,采用方差分析；方差不齐或不符合正态分布时,以中位数（四分位间距）[M（Q）]表示,采用秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3.3 结果 干预后,手术组肠脑组织Fox P3、IL-17含量均高于空白组（P＜0.05）,针刺组、手法组、电针组FoxP3含量高于手术组（P＜0.05）,IL-17含量低于手术组（P＜0.05）,且手法组优于针刺组、电针组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠缺血区脑组织、脑组织FoxP3、白细胞介素-17含量比较[%,M(Q)]

4 讨论

中风常因情志失调、饮食不节导致脏腑阴阳失调、气血逆犯于脑,造成脑脉阻塞而致,临床表现为突然昏仆、偏瘫、舌斜或失语、局部麻木等[7]。中风相当于西医的缺血性脑卒中,是由各种原因引起的脑供血障碍,可对局部脑组织造成不可逆转的损害,引起脑缺血和缺氧性坏死,从而导致相应的神经系统症状[8]。目前临床治疗缺血性脑卒中采用溶栓、抗凝、降纤、降脂、神经保护、改善循环等[9],近年来肠道免疫调节也逐渐应用于临床[10]。肠道免疫状态失调是缺血性脑卒中的常见情况,目前临床尚无特异性治疗方法。近年来,中医药应用于中风后的康复治疗,特别是针灸普遍应用于临床,疗效显著。临床研究显示,针刺能促进缺血性脑卒中患者肢体功能恢复,缩短康复时间,提高生活质量[11]。

本课题组以经络学说为基础,以针刺手法为主,穴位配伍为辅,探究针刺对MCAO模型大鼠免疫调节状态的影响。实验时按照疏通经络气机、调和阴阳的治疗原则选取穴位。百会通达诸经,调节百脉气血,为治疗中风病要穴；脾俞、肾俞为脾肾的背俞穴,可调补先后天之本；膈俞、后三里调补脾胃气血,可使气血生化之源健旺。针刺后,应用针刺手法保持足够的刺激。各穴相配,手法相应,可使气至病所,调节胃肠免疫。

肠道微生物是人体最丰富的菌群共生区室,已成为淋巴细胞种群的有效调节剂,包括调节性T细胞和辅助性T细胞,这两种细胞均参与脑缺血性损伤,研究表明针灸可有效调节肠道免疫细胞[12]。辅助性T细胞位于肠上皮细胞表面,具有天然免疫特性,可通过分泌IL-17,向中性粒细胞和单核细胞等外周粒细胞产生趋化信号,从而加重缺血性脑损伤[13]。研究表明,T细胞参与缺血性脑卒中的病理过程,但其在神经保护过程中并不是直接作用于脑缺血组织,而是通过调节免疫应答系统发挥作用[14]。FoxP3为T细胞重要的表达物质,具有较强的血管调节作用,当FoxP3表达减少,会使FoxP3介导的血管收缩,引起血小板聚集和释放,导致神经系统微循环出现障碍,从而使脑组织血流量进一步降低[4]。本研究结果显示,针刺、手法可通过下调炎症因子IL-17、上调FoxP3细胞的含量,激活免疫系统,发挥脑保护作用,从而改善脑缺血大鼠脑组织功能,起到双向调节肠脑的作用（P＜0.05）,其中手法组作用较为显著。

综上所述,针刺通过调节IL-17、Fox P3发挥对MCAO模型大鼠的脑保护作用,但还需进行重复性实验,以进一步验证其作用；同时可进行临床试验,检测患者肠道菌群,以更加客观地分析菌群与免疫细胞的调节变化情况,以期为针灸从调控免疫机制方面治疗脑卒中提供新思路。