钟 石，吴伟杰，霍进喜，陈慧芝，孙雨晴，牛 犇，马焕艳，潘美良，李有贵＊

（1. 浙江省农业科学院，浙江 杭州 310021； 2. 浙江省农业技术推广中心，浙江 杭州 310020）

浙江是我国传统的栽桑养蚕地区，拥有桑园面积达80000 hm2。随着经济发展，蚕农养蚕效益明显下滑，浙江养蚕面积逐年锐减，大量桑园废弃，造成资源浪费。而桑叶是一种药食两用的植物资源[1]，含有多种活性物质[2]，如生物碱、黄酮、多糖、甾醇等，具有降血糖[3]、降血脂[4]、抗氧化[5]和抗肿瘤[6]等多种功效。其中桑叶降血糖早在《本草纲目》等古代医书中就有记载“能止消渴”，而现代研究表明桑叶中的1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是其起到降血糖作用的主要活性成分之一，它是一种天然α-糖苷酶抑制剂[7，8]，是唯一国际公认的零伤害生物制剂[9]，具有降糖脂[10～14]、抗肿瘤[15]、抗病毒[16]、抗炎[17]等多种药理活性，受到全世界的广泛关注。

本研究在参考已有方法的基础之上[8]，采用单因素考察试验，逐一优化了桑叶DNJ 的提取测定方法，并考察该提取测定方法的精密度、重复性、回收率、中间精密度等参数，最后利用该方法测定不同品种桑叶中DNJ 的含量，从而可为桑叶DNJ 含量测定提供方法依据，为后续从不同品种桑叶中筛选高含量的桑叶材料提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试桑叶品种

桑叶DNJ提取方法优化研究中所用桑树品种为“农桑14号”，供测试的24个品种（表1）桑叶样品于2022年5月采摘自浙江省农科院桑园试验区，40 ℃烘干粉碎后备用。

表1 供试桑品种Table 1 List of mulberry leaves species

1.1.2 仪器与耗材

WATERS600 液相色谱仪，SunFireTMC18 色谱柱，2414 检测器，烘箱，ML-204 分析天平（MET⁃TLER-TOLEDO，上海），HH-6 恒温水浴锅（晶玻实验仪器公司），KQ-250E型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），DNJ标准品（sigma），FMOC-CL（sig⁃ma），乙腈（Tedia），硼酸钾，甘氨酸，醋酸，乙醇，甲醇等均为AR。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制备

精密称取25 mg DNJ标准品，加适量纯水溶解，定容于25 mL 容量瓶中，配成1 mg/mL 的DNJ 标准液。

精密吸取12.5、25、50、100、200 μL 的DNJ 标准液入试管中，分别用0.05 mol/L HCl液补足至1 mL，混匀，得到12.5、25、50、100、200 μg/mL 的DNJ 标准品溶液。

取10 μL试液，与10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸钾缓冲液在1.5 mL试管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CL（溶解于乙腈中），迅速混匀并在30 ℃的水浴锅中反应30 min。加10 μL 0.1 mol/L甘氨酸液终止反应。反应液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀释后进行高效液相色谱（HPLC）分析。

HPLC 分析条件为：分离柱SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相0.05%醋酸与乙腈的体积比为65∶35，柱温为室温，流速1 mL/min，进样量10 μL，采用2414检测器采集荧光信号，测定峰面积。

1.2.2 桑叶DNJ提取方法优化

1.2.2.1 粉碎粒度考察

取本品分别过50 目筛、65 目筛的粉末约0.2 g，精密称定，置50 mL离心管中，加入50 mL 0. 05 mol/L HCl溶液为提取剂，超声波（40 KHz）提取60 min，10000 rpm 离心10 min，保留上清液，其余操作同标准曲线测定步骤，重复三次。

1.2.2.2 提取液考察

取本品粉末约0.2 g，精密称定，置50 mL 离心管中，加入50 mL 纯水、50%乙醇、50%甲醇溶液为提取剂，超声波提取60 min，10000 rpm离心10 min，保留上清液，其余操作同标准曲线测定步骤。

1.2.2.3 提取液pH值

取本品粉末约0.2 g，精密称定，置50 mL 离心管中，加入50 mL pH=1.0、pH=2.0、pH=4.0、pH=6.0、pH=8.0、pH=10.0 缓冲液为提取液，超声波提取60 min，10000 rpm离心10 min，保留上清液，其余操作同标准曲线测定步骤。

1.2.2.4 提取液体积

取本品粉末约0.2 g，精密称定，置50 mL 离心管中，加入25、50、100、150、200 mL提取溶液为提取剂，超声波提取60 min，10000 rpm离心10 min，保留上清液，其余操作同标准曲线测定步骤。

1.2.2.5 超声提取时间考察

取本品粉末约0.2 g，精密称定，置50 mL 离心管中，加入0.05 mol/L HCl 溶液的提取液，超声波提取20、40、60、80、100 min，10000 rpm离心10 min，保留上清液，其余操作同标准曲线测定步骤。

1.2.2.6 衍生化温度

精密量取供试品溶液10 μL，置1.5 mL 离心管中，与10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸钾缓冲液在1.5 mL试管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CL（溶解于乙腈中），迅速混匀并在25、30、40、50、60 ℃的条件下反应30 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液终止反应，其余操作同标准曲线测定步骤。

1.2.2.7 衍生化时间

精密量取供试品溶液10 μL，置1.5 mL 离心管中，与10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸钾缓冲液在1.5 mL 试管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混匀并在室温条件下反应0、10、20、30、40、50、60 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液终止反应，其余操作同标准曲线测定步骤。

1.2.2.8 精密度考察

取本品粉末约0.2 g，精密称定，加入200 mL 0.05 mol/L HCl 溶液的提取液，超声波提取60 min，10000 rpm离心10 min，保留上清液。

精密量取同一供试品溶液10 μL 6份，置1.5 mL离心管中，与10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸钾缓冲液在1.5 mL试管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混匀并在室温条件下反应10 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液终止反应。反应液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀释后进高效液相，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品溶液中DNJ的含量，计算，即得。

含量RSD不大于3%，说明精密度良好。

1.2.2.9 重复性考察

取本品粉末约0.2 g，精密称定，加入200 mL 0.05 mol/L HCl 溶液的提取液，超声波提取60 min，10000 rpm离心10 min，保留上清液。各平行操作6份。

精密量取同一供试品溶液10 μL置1.5 mL离心管中，与10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸钾缓冲液在1.5 mL 试管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混匀并在室温条件下反应10 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液终止反应。反应液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀释后进高效液相，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品溶液中DNJ的含量，计算，即得。

含量RSD不大于3%，说明重复性良好。

1.2.2.10 回收率考察

取本品粉末约0.2 g，精密称定，加入一定量的DNJ（相当0.1 g样品含量的80%、100%、120%，各平行操作3份），用200 mL 0.05 mol/L HCl 溶液的提取液超声波提取60 min，10000 rpm 离心10 min，保留上清液。

精密量取供试品溶液10 μL，置1.5 mL 离心管中，与10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸钾缓冲液在1.5 mL 试管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混匀并在室温条件下反应10 min。加10 μL 0.1 mol/L甘氨酸液终止反应。反应液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀释后进高效液相，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品溶液中DNJ的含量，计算，即得。

各回收率在92%～105%之间，RSD 不大于3%，说明准确度良好。

1.2.2.11 中间精密度试验

由不同实验人员于不同时间取本品粉末约0.2 g，按重复性考察试验，平行操作6 份，于不同仪器上测定，12份样品含量RSD不大于3%，说明中间精密度良好。

1.2.3 数据处理

采用Excel 2013对实验数据进行处理。

2 结果

2.1 粉碎粒度对DNJ含量测定的影响

从图1 中可以看出，经过50 目筛、65 目筛后的样品，测得的桑叶DNJ含量分别为0.17%、0.08%，因此选择桑叶DNJ含量较高的50目筛作为粉碎粒度。

图1 粉碎粒度对桑叶DNJ含量测定的影响Fig. 1 Effect of Grinding Size on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.2 提取溶剂考察

从图2 中可以看出，不同的提取溶剂对桑叶DNJ含量影响较大，利用H2O、50%甲醇、50%乙醇作为提取溶剂，桑叶DNJ 含量分别为0.15%、0.04%、0.08%，因此选择DNJ 含量较高的超纯水作为提取液溶剂。

图2 提取溶剂对桑叶DNJ含量测定的影响Fig. 2 Effect of Extraction Solvent on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.3 提取液pH考察

不同提取液pH 对桑叶DNJ 含量影响如图3 所示。从结果中可以明显看出当提取液pH=2 时，桑叶DNJ 含量较高。因此选择DNJ 含量较高的pH=2缓冲液作为提取液。

图3 pH对桑叶DNJ含量测定的影响Fig. 3 Effect of pH on DNJ Content in Mulberry leaves

2.4 提取液体积考察

从图4 中可以看出随着提取液体积的增加，桑叶DNJ 含量随之升高，但是提取液体积增加到一定程度后，DNJ含量趋于平稳。因此，最终选择的提取液体积为200 mL。

图4 提取液体积对桑叶DNJ含量测定的影响Fig. 4 Effect of Extraction Volume on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.5 提取时间考察

从图5中可以明显看出随着提取时间的延长对桑叶DNJ 含量影响不显著，超声20 min～100 min，DNJ 含量分别为0.21%、0.21%、0.22%、0.22%、0.23%。考虑到提取效率，选择用时短的为超声时间，即超声时间为20 min。

图5 提取时间对桑叶DNJ含量测定的影响Fig. 5 Effect of Extraction Time on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.6 衍生化温度考察

DNJ 是一种对温度比较敏感的化学物质，当温度达到一定程度后，DNJ 会发生降解。从图6 可以看出随着衍生化温度的升高，桑叶DNJ 含量随之下降，从0.20%降至0.08%。因此，在DNJ衍生时，选择在25 ℃下进行。

图6 衍生化温度对桑叶DNJ含量的影响Fig. 6 Effect of Derivative Temperature on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.7 衍生化时间考察

从图7 中可以看出，当衍生化时间在10 min～60 min 之间，桑叶DNJ 含量没有明显变化。因此选择衍生化10 min作为反应条件。

图7 衍生化时间对桑叶DNJ含量测定的影响Fig. 7 Effect of Derivative Teme on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.8 精密度考察

对同一样品进行6 次测定，桑叶DNJ 的含量分别为0.26%、0.27%、0.27%、0.26%、0.27%、0.27%，RSD=1.81（n=6），结果表明该测定方法精密度良好。

2.9 重复性考察

测定6 个桑叶样本中DNJ 含量，结果分别为0.25%、0.26%、0.25%、0.24%、0.25%、0.25%，RSD=2.20（n=6），结果表明该测定方法重复性良好。

2.10 回收率考察

表1 显示，本方法的加标回收率在95.89%～103.65%之间，RSD 为2.76%，表明本方法的准确度良好。

表1 DNJ加样回收率（n=9）Table 1 Recovery Rate of DNJ (n=9)

2.11 中间精密度试验

两个实验人员的12 份样品含量RSD 为2.83%，结果表明中间精密度良好（表2）。

表2 中间精密度试验结果Table 2 Results of Intermediate Precision Test

2.12 不同品种桑叶DNJ含量测定

在确定了本研究优化的方法具有良好的精密度、重复性、回收率等之后，本研究测定了桑树资源圃中24 种桑叶DNJ 含量（采摘时间2022 年5 月27日）。结果（见表3）显示，24份样品DNJ含量在0.08%～0.57%之间，不同品种桑叶DNJ含量差异较大。

表3 不同桑叶品种DNJ含量的测定Table 3 DNJ Content in Mulberry Leaves of Different Species

3 结论

本文开展了桑叶DNJ 含量测定的方法学研究。依次考察了桑叶样品的粉碎粒度、提取溶剂、提取时间、衍生化温度、衍生化时间等提取条件对DNJ 含量的影响，最后确定桑叶样品的最优提取测定方法为：桑叶粉碎过50目筛，0.2 g样品加200 mL pH=2.0 缓冲液，超声提取20 min，10000 rpm 离心10 min，保留上清液；精密吸取样品溶液10 μL，置1.5 mL 离心管中，与10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸钾缓冲液在1.5 mL 试管中混合，加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CL（溶解于乙腈中），迅速混匀并在室温条件下反应10 min，加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液终止反应。同时，对该方法进行了系统的方法学验证，完成了精密度、重复性、准确度和中间精密度等试验。验证试验结果表明：该方法专属性好，方法的准确度高、重复性好。测定20多个品种桑叶中DNJ含量，结果发现品种差异较大，可为后续桑叶DNJ的开发利用提供参考依据。