焦若男，刘 琨，孔繁艺，王 婷，韩 雪，李泳江，孙长森

大连理工大学光电工程与仪器科学学院，辽宁 大连 116000

引 言

随着塑料制品的广泛应用，微塑料逐渐成为地球上一种新兴污染物。 微塑料是指尺寸小于5mm的塑料碎片。 由于其形成原因不同，微塑料被分为初级微塑料和次级微塑料，初级微塑料是指直接被制成微观尺寸的塑料，如化妆品中含有的塑料颗粒、药物载体等；次级微塑料是指大的塑料碎片经过物理、化学、生物等过程分解所得到的产物。 微塑料的体积小，表面积大，吸附能力强，扩散范围广。

起初人们对微塑料的研究主要针对海洋生态系统。 但近年来研究表明中国黄渤海海域沉积物中存在约100个·kg-1(干重)左右的微塑料[1]。 不仅在我国海域，在世界各大海域[2]、南极罗斯海[3]、甚至北极海冰[4]中都有微塑料的踪迹。 海洋遭到微塑料的袭击，海洋生物和海产品也不例外。 微塑料不仅被发现存在于虾的体内，在温哥华岛东海岸的幼年奇努克鲑鱼体内[5]、伊比利亚群岛常见的海豚胃中[6]均有微塑料的踪迹。 欧洲鳕鱼、螃蟹、海鸟、南极企鹅、双壳类生物以及市场上购买的冷冻鱼中也发现了或多或少的微塑料，甚至日常生活中不可或缺的海盐中也有微塑料的踪迹。 虽然微塑料广泛存在于海洋生态系统中，但大部分的微塑料都来源于陆地[7]。 耕地是生产粮食必不可少的，但有的高原耕地却也存在严重的微塑料污染[8]，这就可能导致种植出的粮食中含有微塑料。 2019年，Panebianco等首次在陆生蜗牛体内发现了微塑料[9]。 诸如瓶装水、罐装鱼等产品中检测出微塑料的报道表明微塑料这一新兴污染物已经普遍存在于我们身边。

虽然小于20 μm的微塑料不能在组织中转移，但更小尺寸的微塑料被吸收转移的概率会大大增加，如2 μm的微塑料就可被牡蛎吸收[10]。 人类位于生物链的最顶端，微塑料最终会在人体内聚集，引发呼吸道过敏、呼吸困难、咳嗽等症状，进而引发哮喘、心血管类疾病，甚至可能引发癌症，对人体健康产生危害。 微塑料污染日益严重，对生物及人类造成的影响也是不可估量的，因此研究微塑料的来源、传播以及治理问题是刻不容缓的。

目前，人们对于微塑料的提取、检测及鉴定有几种不同的方法。 对于微塑料的提取大多数采用的是浮选法、密度分离法及过滤法，提取出微塑料后再利用显微镜进行目视观察，或运用拉曼光谱技术[11]、傅里叶红外光谱技术[12]、热解气相色谱与质谱法[13]、高光谱成像等进行检测与鉴定。 土壤样品中的微塑料可采用浮选法进行提取，然后利用显微镜观察结合加热法进行鉴定，由于土壤样品中的微塑料受热熔化后会转化为圆形透明颗粒，而有机物、硅酸盐等其他杂质在受热后不发生变化，因此利用加热法进行处理，再利用显微镜进行目视观察，对土壤中的微塑料的提取率可高达90%[14]。 对环境中微塑料的提取一般还较为简单，而提取生物体内的微塑料则需要更复杂的样品处理，首先要消解生物组织中的有机物，可向样品中加入H2O2，HNO3[11]和KOH溶液[12]等试剂达到目的，然后再采用过滤的方式进行提取，最后将过滤所得的滤渣放在高倍显微镜下观察[5]，或结合拉曼光谱、傅里叶红外光谱、高光谱成像等方法进行识别与鉴定。

可见在提取微塑料的过程中不论是哪种方法，都需要较长时间的等待，甚至需要复杂的样品处理。 诸多检测方法中，目视检测对于检测大块的微塑料比较直观，但受主观因素的影响较多，而对于小尺寸微塑料的鉴别，拉曼光谱检测与傅里叶红外光谱检测有一定的优势，但也需要对可疑颗粒进行逐个分析。 鉴于此，开发一种快速、准确鉴别环境中是否含有微塑料的技术是有必要的。 因此提出使用多通道图像采集的方法检测环境中的微塑料，并结合形态学分析与中值滤波的算法直观显示出微塑料在环境中的分布。

选取海水及沙子为研究对象，由于聚苯乙烯和聚乙烯是世界上最常用的塑料，也是海洋环境中最常见的塑料，所以我们选择将聚苯乙烯微球掺入到海水及沙子中模拟被微塑料污染的海水和沙子，在不进行任何处理的情况下，利用多通道图像采集系统同时获得样品白光通道下的图像及相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-stokes Raman scattering, CARS)光谱成像信号，通过CARS光谱成像结合形态学分析与中值滤波算法，直观地显示出海水及沙子中的聚苯乙烯微球的分布，同时与拉曼光谱检测进行了对照。

1 原 理

1.1 CARS光谱成像原理

1965 年，Terhune和Maker等发现了CARS现象。 CARS光谱成像是一种基于非线性光学与分子振动的四波混频过程，在CARS光谱成像过程中，通常使用泵浦光(频率为ωp)和斯托克斯光(频率为ωs)两束光同时激发样品，本研究中采用正向CARS，当两者频率的差值正好等于所要探测的化学键的振动频率ωR(即共振条件ωR=ωp-ωs)，同时又满足匹配条件Ka=2Kp±Ks时，会激发出频率为ωas=2ωp-ωs的反斯托克斯光(图1)。 通过调节延时线使两束光达到匹配从而得到反斯托克斯信号。 CARS光谱成像作为一种成像手段，具有非侵入性、非破坏性、实时性且可三维成像的特点，常被应用于化学、材料、生物和医学等领域，如利用CARS对活体小鼠中C—H化学键进行成像[15]。 CARS光谱成像不需要特殊制备或处理样品，因此把它用来检测环境中的微塑料。

图1 CARS示意图Fig.1 The schematic of CARS process

1.2 算法分析

图2 算法流程图Fig.2 Algorithmic framework

2 实验部分

2.1 仪器及材料

使用RENISHAW(INVIA)拉曼光谱仪(激发波长532 nm，输出功率5.15 mW)、Olympus FV1200MPE系统的多光子激光扫描显微镜(激发波长800 nm，泵浦光功率149 mW，斯托克斯光功率81 mW)、电子天平(上海梅特勒JB/T)、高速离心机(TG16-WS)。

材料为直径10 μm，浓度为0.05 g·mL-1的聚苯乙烯微球(上海麦克林生化科技有限公司)、海水(采集于大连市东港)、沙子(采集于中国大连星海浴场)。

2.2 方法

将10 μL的聚苯乙烯微球与3 mL海水均匀混合作为海水的实验样品。 将聚苯乙烯微球加去离子水稀释至0.001 g·mL-1，取0.5 mL加入到2 g干沙中，混合均匀(用离心机以8 000 r·min-1离心3 min)作为沙子的实验样品。

拉曼光谱在检测环境中的微塑料方面已经是一种成熟的手段，因此将拉曼光谱检测作为一种对照方法。 对样品进行拉曼光谱检测与多通道的图像采集，并进行分析。

采用Origin9.0软件绘制曲线图，采用FV10-ASW 4.2 Viewer进行多通道采集图像的简单处理，采用Matlab R2017a进行算法处理。

3 结果与讨论

3.1 聚苯乙烯微球的拉曼光谱与多通道图像采集

为了能够准确辨别海水及沙子中的聚苯乙烯微球，首先对聚苯乙烯进行了拉曼光谱检测及多通道图像采集。 聚苯乙烯在998，1 597和3 047 cm-1等位置处有明显的拉曼频移，且拉曼频移信号的强度随着微球浓度的降低而减弱(图3)。 选取聚苯乙烯中由苯环内碳原子之间非对称收缩引起的1 597 cm-1处的拉曼频移进行多通道图像采集。 在多通道图像采集中使用800 nm的飞秒激光作为激发光源，通过分光镜将激光分为两束，其中一束光作为泵浦光，另一束光经过光子晶体拓宽为一束宽谱带的光，两束光同时照射在样品上，激发出反斯托克斯信号，通过放置合适的滤光片，得到特定波数的CARS光谱成像信号，此处采用的为正向的。 在CARS光谱成像通道中放置(710±6.5) nm的滤光片可获取1 597 cm-1拉曼频移处的信号，调节延时线使其相位匹配，得到了聚苯乙烯的以1 597 cm-1为中心的多通道图像采集信号(图4)，其CARS光谱成像信号与白光通道下聚苯乙烯的轮廓可以一一对应，且不会随着小球的浓度变化而发生变化。

图3 不同浓度聚苯乙烯微球的拉曼光谱图Fig.3 Raman spectrum of polystyreneat different concentrations

3.2 海水中微塑料的检测

在对海水中的聚苯乙烯进行多通道图像采集时，信号明显且与白光通道下观察到的聚苯乙烯轮廓一一对应。 由于激光照射加快了海水蒸发的过程并析出盐颗粒，海水发生了结晶，虽然结晶部位有微弱的CARS光谱成像信号，但经过一次开运算算法，可以直观地看到聚苯乙烯在海水中的分布(图5)。

图4 以1 597 cm-1为中心的聚苯乙烯微球的多通道成像(a)： 白光通道成像；(b): CARS光谱成像Fig.4 Multi-channel imaging of polystyrenecentered at 1 597 cm-1(a)： The white light imaging；(b): The CARS imaging

图5 以1 597 cm-1为中心的聚苯乙烯在海水中的多通道成像(a)： 白光通道成像；(b): CARS光谱成像Fig.5 Multi-channel imaging of polystyrenecentered at 1 597 cm-1 in seawater(a)： The white light imaging；(b): The CARS imaging

适当增加多通道图像采集的曝光时间，可以使以1 597 cm-1为中心的聚苯乙烯信号更加清晰(图6)。 虽然结晶部位的信号也得到了增强，但结晶的信号普遍位于结晶部位附近，对检测结果影响不大。 进行长时间的连续扫描时，以1 597cm-1为中心的聚苯乙烯信号强度减弱，原因可能是长时间的照射，激光的热量过高导致小球熔化，如图7所示，箭头所指位置为含有聚苯乙烯的位置。 可以看出，多通道图像采集在检测海水中聚苯乙烯时不受其他成分干扰，可以快速直观地看到聚苯乙烯的分布情况，虽然随着照射时间增长，局部热量导致水分蒸发，海水结晶，会对成像有一定的影响，CARS系统的单幅扫描成像时间可以在几秒钟完成，完全可以避免海水结晶的干扰。

图6 不同曝光时间下海水中聚苯乙烯的CARS光谱成像信号(a)： 曝光时间2 μs·像素-1；(b): 曝光时间8 μs·像素-1

图7 连续扫描下海水中聚苯乙烯的CARS光谱成像信号Fig.7 CARS imaging of polystyrene in seawaterunder continuous scanning

3.3 沙子中的微塑料检测

在对沙子中的微塑料进行检测之前，由于沙子中有较大颗粒，其大小远远超出聚苯乙烯微球的大小，为了避免沙子本身信号形成的干扰，首先对沙子进行了检测。

为了检测沙子与聚苯乙烯是否有重叠的拉曼频移，我们对沙子进行了拉曼光谱检测。 由于沙子普遍有较强的荧光信号，在700～3 200 cm-1波数范围内只有一个大的荧光峰，没有明显的拉曼频移。 对所得拉曼光谱图进行了去基线处理，取100～700 cm-1波数范围的拉曼光谱，如图8所示(为了直观地区分沙粒的颜色，图8中同时展示了显微镜下沙粒的形态)。 沙子在479 cm-1处有较小的拉曼频移，随着沙粒颜色逐渐变浅，该拉曼频移的信号强度逐渐增强，同时在125，201和461 cm-1位置处出现了新的拉曼频移。 由于沙子主要是由矿物和微小的岩石碎片组成，且具体成分因地而异，我们认为拉曼频移及强度的差异是由于不同沙粒组成成分及含量的不同导致的。 在对沙子进行多通道图像采集时，浅色的接下来对沙子与聚苯乙烯混合后的样品进行拉曼光谱检测，沿一直线取十个点依次进行拉曼光谱检测，沙子有强烈的荧光，对所得数据进行去基线处理后，发现只有在激光聚焦在聚苯乙烯存在的位置时，才能检测到微弱的信号(图10)。 对沙子中的单个聚苯乙烯进行检测，聚苯乙烯的大部分信号会被沙子的强荧光遮住，进行去基线及平滑处理后，可以看到较小的信号(图11)。 由此可见，运用拉曼光谱检测的方法来检测沙子中的聚苯乙烯具有一定的局限性，若要准确的测得沙子中是否含有聚苯乙烯就要进行拉曼逐点扫描成像，这一过程非常耗时，且沙子的荧光对聚苯乙烯的检测有较大影响，需要进一步的数据处理才能得到想要的结果。

图8 不同沙粒的拉曼光谱图Fig.8 Raman spectrum of different sand

沙粒几乎没有CARS光谱成像信号，而深色沙粒有较强的CARS光谱成像信号(图9)，这也进一步证实了不同颜色的沙粒组成成分的不同。 对于细小沙粒，CARS光谱成像信号多为小且离散的信号，这与以1 597 cm-1为中心的聚苯乙烯的信号相比有较大的差别。

图9 沙粒的多通道成像 (a)，(b) 分别为透明沙粒的白光及CARS光谱成像信号； (c)，(d) 分别为深色沙粒的白光及CARS光谱成像信号Fig.9 Multi-channel imaging of sand

对其进行多通道图像采集，与海水的多通道图像采集结果不同，沙子对聚苯乙烯的检测有一定的干扰。 如图11所示，CARS光谱成像信号中有大且聚集信号和一些点状离散信号。 将白光通道成像与CARS光谱成像信号进行对比，发现较大且聚集的信号与聚苯乙烯的轮廓相符(图12)，其中黄色圆圈标记的位置是可以确定为聚苯乙烯的位置，点状离散信号可以确定为沙子本身的信号，在该检测过程中为干扰信号。 由于在CARS光谱成像信号中并不能明显地从沙子中辨别出聚苯乙烯，对图像进行算法处理。 因为聚苯乙烯与沙子的信号尺寸差距较大，首先采用滤波算法进行处理。 然而经过3×3的中值滤波算法后仍然存在大范围的沙子信号的干扰[图13(a)]。 由于聚苯乙烯微球有一定的体积，在进行多通道图像采集过程中可能存在不同的聚苯乙烯微球在不同的焦平面从而使得聚苯乙烯的信号不够均匀，边界不够平滑，这可能导致在滤波过程中将有效信息滤除，因此提出运用先腐蚀后膨胀的开运算算法，得到的结果仍然不够直观[图13(b)]。 经过多次试验，发现腐蚀膨胀与中值滤波相结合的算法可以得到较好的结果。 首先通过3×3的中值滤波结合图像腐蚀算法去除掉沙子的点状信号，再经过中值滤波结合膨胀算法填充聚苯乙烯的信号，使其信号均匀，边界平滑，便于观察。 经此过程可以滤除掉大部分沙子的点状离散信号而保留聚苯乙烯的大且聚集信号。 虽然所得结果不够精确，但能够直观地看到聚苯乙烯在沙子中的分布[图13(c)]。

图10 含有聚苯乙烯的沙子中不同位置的拉曼光谱图Fig.10 Raman spectrum of different locationsin sand containing polystyrene

图12 以1 597 cm-1为中心的聚苯乙烯在沙子中的CARS光谱成像信号Fig.12 CARS imaging of polystyrene insand centered at 1 597 cm-1

图13 不同算法处理后的以1 597 cm-1为中心的聚苯乙烯在沙子中的CARS光谱成像信号(a)： 仅中值滤波；(b): 开运算；(c): 滤波与开运算结合Fig.13 CARS imaging of polystyrene in sand after processing by algorithm(a)： Median filter; (b): Erode and dilation; (c): Corrosion and expansion combined with median filtering

4 结 论

运用多通道图像采集的方法快速检测出海水及沙子中的微米级聚苯乙烯。 对于毫米级的微塑料，该检测手段的准确率将大幅提高。 对于不同种类的微塑料，如聚乙烯、聚丙烯等，可以以不同的拉曼频移为中心，选用对应的滤光片进行成像。 与目前其他检测手段相比，在不进行预处理的情况下，多通道图像采集对于微米量级的微塑料可以快速识别，也展现出了其对环境中的微塑料检测方面应用潜力。