李柏茹，秦双建，#，蔡 颖，李闰冰，关 岚，肖 芳，曾 明，徐新云

(1．中南大学湘雅公共卫生学院，湖南 长沙410078；2．南华大学公共卫生学院，湖南衡阳 421001；3．深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518055)

大气细颗粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)污染是国内外一直关注的公共卫生问题。《2015年全球疾病负担(global burden of disease，GBD)研究》将PM2.5列为第五大死亡因素，并且PM2.5导致了全球420万人死亡和1.031亿残疾调整生命年(disability adjusted life year，DALYs)损失[1]。据估计，2017年中国有124万人的死亡可归因于空气污染，其中85.166万人的死亡来自环境PM[2]。PM2.5可通过氧化应激、炎症反应、免疫紊乱、DNA损伤和遗传毒性、信号通路改变等机制对机体造成损伤[3]。长期的PM2.5暴露会使肺癌患者的死亡率明显增加，并且确诊后的肺癌患者生存期也会缩短，说明PM2.5在肺癌进展方面具有一定的促进作用[4]。作为人体主要代谢器官的肝脏也是PM2.5的作用器官之一，调查研究发现确诊的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者暴露于PM2.5可能会缩短其生存期，并且随着暴露浓度的升高产生更加严重的影响[5]。同时国外一项流行病学调查发现室外空气污染与肾癌的发生密切相关[6]。将A549细胞暴露于25和50μg/mL的北京市可吸入颗粒物PM10水溶性成分持续48 h，可显著抑制miR-26a并上调lin-28同源物B(lin-28 homolog B，LIN28B)，进而激活A549细胞中的白介素6(interleukin 6，IL-6)以及信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，从而促进上皮-间质并加速细胞侵袭迁移能力[7]。岳慧峰等[8]收集太原市郊区住宅区PM2.5和PM10，随后实验发现PM2.5和PM10可以通过活性氧(reactive oxygen species，ROS)介导的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)活化和细胞外基质降解途径诱导A549细胞迁移和侵袭增强。PM2.5可通过促进血管内皮细胞介导的肿瘤血管新生、激活肿瘤细胞生成拟态直接形成肿瘤血管、使肿瘤干细胞向肿瘤内皮细胞转化、诱发局部慢性炎症反应从而发生EMT、破坏血管稳态、增加血管通透性等途径促进癌细胞侵袭和迁移[9]。

目前有很多关于PM2.5增强癌细胞侵袭和迁移能力的假说，但鲜有见到低浓度PM2.5急性染毒也可以促进肺、肝和肾癌细胞迁移及侵袭的实验研究，因此本研究旨在探究低浓度PM2.5是否可以促进癌细胞侵袭和迁移。课题组前期已经发现，PM2.5可以刺激人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells，HBE)、人正常肝细胞(human liver cell L02，L02)和人肾上皮细胞(human kidney 2 cells，HK-2)中部分原癌基因表达升高，表明PM2.5染毒对正常细胞中癌基因的表达具有促进作用[10-11]，但PM2.5对相应的癌细胞是否具有促进作用即对其侵袭迁移的影响亟待发现。因此本文以人肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞和人肾癌A498细胞3种癌细胞为研究对象，检测PM2.5对3种细胞迁移、侵袭能力的影响，为探讨PM2.5对癌细胞侵袭和迁移能力的影响提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

A549细胞、HepG2细胞和A498细胞购于中国科学院上海细胞库；Transwell小室购于美国Corning公司；Matrigel基质胶购于美国Corning公司；结晶紫购于上海碧云天公司；多聚甲醛购于国药集团生物有限公司；DMEM培养液、MEM培养液、胎牛血清及0.25%Trpsin-EDTA购于美国Gibco公司；生物显微镜Leica DM3000购于德国Leica公司；TH150F中流量采样器购于武汉天虹公司。

1.2 PM2.5样品采集与制备

用武汉天虹TH150F中流量采样器和80 mm直径的石英滤膜，按100 L/min的流量连续采样24 h，连续采样3 d，采样地点设置在太原山西大学校园，采样时间为秋冬季。采集前后对滤膜称重，采集后将滤膜剪成2 cm×2 cm放于烧杯中，加入超纯水完全浸没滤膜，杯口用锡箔纸密封，超声震荡30 min后取出滤膜，将PM2.5样品悬液转移到干净的真空冷冻物料盘中，再次密封物料盘口后，于-80℃冰箱冷冻24 h；取出后，用封口膜替换锡箔纸密封物料盘，扎孔，于真空冷冻干燥机中至PM2.5完全干燥；将物料盘放在超净工作台中紫外灯灭菌2 h，用高压灭菌的超纯水溶解干燥的PM2.5颗粒，混合均匀完成PM2.5混悬液的制备，分装标记后于-20℃保存待用，每次使用前振荡混匀。

1.3 细胞培养与染毒

使用完全培养基(含10%胎牛血清的DMEM或MEM)于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养A549、HepG2和A498细胞，传代时将细胞传至6孔板，待细胞状态稳定且汇合度达80%时进行染毒。本课题组前期开展大量实验探索短时间低剂量的PM2.5染毒正常细胞后产生的危害作用，已经利用10和50 μg/mL的PM2.5染毒人支气管上皮细胞、人正常干细胞和人肾上皮细胞24 h，并发现这两个浓度的PM2.5染毒24 h可以导致正常细胞癌基因表达发生明显的变化[11-13]，所以本实验拟在此基础上初步探索相同终浓度的PM2.5染毒24 h对3种癌细胞迁移和侵袭能力的影响。故本实验将终浓度为10和50μg/mL的PM2.5设定为低剂量染毒组和高剂量染毒组，将不含血清的DMEM或MEM培养基作为阴性对照组，染毒3种癌细胞24 h。

1.4 Transwell小室侵袭和迁移实验

在24孔细胞培养板中加入含10%FBS的DMEM或MEM培养基，取出4℃冰箱中解冻的Matrigel(基质胶)按1∶8的比例用不含FBS的培养基稀释，取100 μL铺满Transwell小室底部(Transwell孔径为8μm)，并在37℃培养箱中孵育过夜，形成基质屏障膜。将染毒24 h后的细胞消化下来并用无血清培养基制成浓度为1×105个/mL浓度的细胞悬液，每小室滴加200 μL，于37℃培养箱中培养24 h，结束后取出Transwell小室，并用PBS洗涤2次后，用多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色35 min，把没有穿过膜的细胞用棉签小心擦除，在正置显微镜下随机选取5个视野，计数穿膜细胞的数目并取均值。迁移实验也采用Transwell小室法，除不包被Matrigel基质胶外，其余步骤与侵袭实验相同。

1.5 统计分析

实验均独立重复3次，采用GraphPad Prism 6.0分析作图，计量资料以±s表示，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PM2.5染毒增强A549细胞的迁移、侵袭能力

Transwell小室法迁移实验结果如图1所示，阴性对照组、10和50μg/mL PM2.5染毒组中穿膜细胞数分别为(356.33±30.92)、(476.33±28.50)和(563.33±74.00)个。侵袭实验结果如图2所示，阴性对照组、10和50μg/mL PM2.5染毒组中穿膜细胞数分别为(188.33±9.45)、(313.00±7.94)和(404.00±57.66)个。上述结果表明10和50μg/mL的PM2.5可使A549细胞的迁移、侵袭能力增强(P＜0.05或0.01)。

图1 Transwell法检测PM2.5对A549细胞迁移能力的影响

图2 Transwell法检测PM 2.5对A549细胞侵袭能力的影响

2.2 PM2.5染毒增强HepG2细胞的迁移、侵袭能力

Transwell小室法迁移实验结果如图3所示，阴性对照组、10和50μg/mL PM2.5染毒组中穿膜细胞数分别为(86.42±4.75)、(140.00±16.15)和(234.17±9.06)个。侵袭实验结果如图4所示，阴性对照组、10和50 μg/mL PM2.5组中穿膜细胞数分别为(48.33±3.26)、(97.75±6.63)和(123.92±8.57)个。上述结果表明：与阴性对照组比较，10和50μg/mL的PM2.5可使HepG2细胞的迁移、侵袭能力增强，差异均具有统计学意义(P＜0.05或0.01)。

图3 Transwell法检测PM2.5对Hep G2细胞迁移能力的影响

图4 Transwell法检测PM 2.5对Hep G2细胞侵袭能力的影响

2.3 PM2.5染毒增强A498细胞的迁移、侵袭能力

Transwell小室法迁移实验结果如图5所示，阴性对照组、10和50μg/mL PM2.5组中穿膜细胞数分别为(42.33±6.43)、(80.00±6.08)和(174.67±25.01)个。侵袭实验结果如图6所示，阴性对照组、10和50μg/mL PM2.5组中穿膜细胞数分别为(5.67±5.03)、(21.33±5.13)和(40.67±6.81)个。上述结果表明：与阴性对照组比较，10和50μg/mL的PM2.5可使A498细胞的迁移、侵袭能力增强，差异均具有统计学意义(P＜0.05或0.01)。

图5 Transwell法检测PM2.5对A498细胞迁移能力的影响

3 讨论

肿瘤细胞的转移是癌症复发以及治疗失败的重要原因，且肿瘤细胞的转移过程非常复杂，涉及多条信号通路、转录因子及酶的活化。但是过去关于PM2.5与癌症的研究多集中在PM2.5致正常细胞和癌细胞损伤等作用方面[14-15]，却未见关于PM2.5对癌症早期转移的研究报道。因此本研究就PM2.5对肺癌细胞、肝癌细胞和肾癌细胞的侵袭和迁移能力进行了检测，结果发现PM2.5可以明显增强3种癌细胞的侵袭和迁移能力。

肺癌是目前人类所有癌症中发病率最高的癌症，在2018年全球新增癌症中肺癌占11.6%[16]，同时肺癌也是死亡率最高的癌症，在2018年全球全部死亡病例中肺癌占18.4%[17]。随着工业化的发展，环境与健康的关系逐渐得到了人们的重视，有流行病学调查显示PM2.5与包括肺癌在内的多种呼吸系统疾病的进展有着密切关联[18]。本研究得到10和50μg/mL PM2.5可以增强A549细胞的侵袭和迁移能力，提示PM2.5可能在肺癌的转移过程中发挥着一定的作用。有学者在研究中发现，PM2.5可通过提高Wnt/β-catenin通路活性及其下游cyclin D1、snail、slug、MMP-2和MMP-9的蛋白表达或者是转移相关蛋白-细胞钙黏蛋白-N的表达量，降低钙黏蛋白-E的表达量从而增强A549细胞的迁移、侵袭能力，进一步导致肺癌转移发生率增加[19-20]。肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，病死率排在所有肿瘤中第2位，不但恶性程度高，而且进展迅速、病死率高[21]。随着医疗条件的改善进步，肝癌患者生存率虽大幅度提高，但高转移率和高复发率依旧是肝癌治疗的最大障碍[22]。目前很少有关于PM2.5与肝癌转移的相关机制研究报道，但是有学者已经发现PM2.5可以缩短肝细胞癌患者的生存期[5]，说明PM2.5可能在肝癌的进展中发挥着一定的作用。本研究发现PM2.5可以增强HepG2细胞的侵袭和迁移能力，这与上述的PM2.5缩短肝细胞癌患者生存期相一致，说明PM2.5可能也在肝癌的转移过程中起着一定的促进作用，国内学者也发现PM2.5可以激活RACα-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶导致人基质金属蛋白酶-13的过度表达，刺激HCC细胞的迁移和侵袭[23]。肾癌是起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤，尽管在所有肿瘤中肾癌的发病率偏低，但是近年来中国肾癌的发病率和死亡率均呈现上升趋势[24]。目前肾癌常用的疗法包括手术、放化疗和中医辅助治疗等，但同大多数肿瘤类似，肾癌细胞也易于发生远处转移，对于这些晚期肾癌患者，临床上仍然缺乏有效的治疗方式导致远期预后仍较差[25-26]。虽然已有流行病学研究发现PM2.5与肾癌的发生有关，但仍未有PM2.5增强肾癌转移的研究报道。本研究发现PM2.5可以使得A498细胞的迁移和侵袭能力增强，与肺癌和肝癌的相关研究结果类似。肾癌转移主要是通过肿瘤分泌促进血管内皮生长因子以大量生成肿瘤内血管[27]，配合淋巴管进行全身性播散，与此同时肿瘤细胞在进展过程中发生EMT，肿瘤细胞失去细胞极性，细胞之间的连接变少，增加细胞迁移和侵袭的能力[28]。邹寒冰等[29]发现当抑制RAP1-JNK信号途径时，会促进ACHN细胞发生间质-上皮转化，可以有效抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，为后续进行PM2.5促进肾癌细胞侵袭迁移能力的机制研究提供了新思路。

本研究初步发现太原市PM2.5可以促进肺癌细胞、肝癌细胞和肾癌细胞的侵袭和迁移，具有一定创新性，但仍存在一些不足，如未对侵袭迁移相关的特异性生化指标、蛋白指标进行测定以证实PM2.5对癌细胞侵袭迁移的促进作用。实验中所用细胞均为传代次数不超过10代、生长状态良好且无微生物污染细胞，进行侵袭迁移实验时3种细胞均按照完全相同的处理方法进行，染毒所用PM2.5样品均为同一批次制作完成，以减少细胞状态和PM2.5样品批次对侵袭迁移结果的影响。本研究结果表明，PM2.5可促进人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2和人肾癌细胞A498的侵袭和迁移，PM2.550μg/mL剂量组比10μg/mL剂量组的促进作用更明显，提示PM2.5对癌细胞侵袭和迁移有促进作用，为今后进一步深入开展PM2.5的致癌机制和对癌细胞侵袭、迁移的调控机制提供了科学依据。