陶 毅，王凯飞，宋立成，付 晗，宋雨薇，薛少云，解立新 解放军医学院，北京 0085； 解放军总医院 呼吸与危重症医学部，北京 0009； 张家口市肺科医院，河北张家口 075000

根据世界卫生组织2019年全球卫生估计报告，下呼吸道感染是全球最致命的感染性疾病，也是2019年全球第四大死因[1]。对于下呼吸道感染，特别是医院获得性肺炎，最常见的感染病原体为细菌，包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等[2]。因此下呼吸道感染的诊治首先要明确是否细菌感染。随着纤维支气管镜的发展，支气管肺泡灌洗逐渐被引入临床实践中[3-4]。患者对支气管肺泡灌洗耐受性好，并发症相对较少。支气管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF)标本又被称为“液体活检”，是在反映下呼吸道、远端气道和肺泡生理病理状态的同时提示可能感染病原体的珍贵标本[5-6]。然而，由于支气管肺泡灌洗操作过程中污染或环境细菌定植等原因，BALF中观察到的细菌是否为感染病原体仍有待商榷。正常人BALF细胞分类中中性粒细胞≤3%，在难治性哮喘、慢性支气管炎、特发性肺纤维化等疾病中，中性粒比例可升高。目前国内外研究对于肺部细菌感染患者BALF中细胞比例特点尚无统一标准[6-8]。因此，本研究回顾性总结肺部细菌感染患者BALF细胞分类特点，分析BALF分类计数中中性粒细胞比例对于下呼吸道细菌感染的诊断价值。

资料与方法

1 资料来源 选取 2018 年 1 月- 2020 年 12 月解放军总医院第一医学中心送检BALF细胞分类计数的患者资料。入选标准：1)性别不限，年龄≥18岁；2)曾行床旁支气管肺泡灌洗并留取标本送检细胞分类计数；3)胸部CT提示肺部阴影。排除标准：1)胸部CT提示肺间质性病变；2)既往有血液系统疾病；3)BALF标本质量不合格：鳞状上皮≥5%或柱状上皮≥20%或BALF量少于5 mL；4)临床病历资料不完整。

2 BALF 细胞分类计数方法 1)按指南中推荐的标准流程采集BALF[8]，标本送至实验室后立即处理。先观察并记录灌洗液的性状、颜色和总量，如含黏液成分，用无菌纱布过滤或0.1%二硫苏糖醇溶解后处理；2)将上述BALF于4℃ 下 250 ~300 g离心10 min，留取上清液用作可溶性成分检测，以 3 ~ 5 mL 0.9% 氯化钠注射液重悬细胞沉淀制成细胞悬液；3)用计数板计算细胞总数，若细胞数过高，可用0.9%氯化钠注射液稀释调整为5×106/mL；4)将充分重悬的细胞悬液 50 µL 滴于载玻片上，载玻片冷风干燥后，用苏木精-伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色；5)先在光学显微镜低倍视野(小于40×)下观察整片，然后在高倍视野(40×及以上)下进行细胞分类与计数，计数至少400个细胞。典型BALF标本1 000倍油镜下表现见图1。

图1 BALF标本细胞分类1 000×油镜下表现A：BALF标本镜下表现；B：质量差的BALF标本镜下表现；C：肺部细菌感染患者BALF标本镜下表现；D：嗜酸性粒细胞肺炎患者BALF标本镜下表现Fig.1 The BALF cell patterns under 1 000× oil microscope A: cell pattern of qualified BALF specimen; B: cell pattern of unqualified BALF specimen; C: cell pattern of BALF specimen indicating pulmonary bacterial infection; D: cell pattern of BALF specimen indicating eosinophilic pneumonia

3 分组及分析指标 根据患者最终临床诊断分为细菌感染组与非细菌感染组。BALF细菌培养阳性、最终诊断为支原体、衣原体等非典型病原体及结核感染的肺炎患者可诊断为肺部细菌感染，根据患者的临床表现，结合影像学、实验室病原学检查以及抗菌药物应答情况判断治疗效果，明确患者最终临床诊断。依据2018年中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南[2]，肺炎定义为胸部X线检查或CT检查显示新出现的或进展性的浸润影、实变影或磨玻璃影，加上下列3种临床症状中的2种或以上，可建立临床诊断：1)发热，体温＞38℃；2)脓性气道分泌物；3)外周血白细胞＞10×109/L或＜4×109/L。分析指标：对两组患者BALF中巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞比例进行统计分析。

4 统计学分析 采用 SPSS23.0 统计软件。正态计量资料以±s表示，组间比较采用成组t检验。偏态计量资料采用中位数Md(IQR)表示，组间比较采用成组秩检验。计数资料比较采用χ2检验或精确概率检验。采用ROC曲线分析BALF中性粒细胞比例对于肺部细菌感染的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 纳入标本的患者信息资料比较结果 纳入141份标本，其中细菌感染组109例，包括男性70例，女性39例，年龄(65±16)岁；非细菌感染组32例，其中男性22例，女性10例，年龄(61±17)岁，两组患者性别、年龄、基础疾病分布差异均无统计学意义(P＞0.05)(表1)。最终诊断为肺部细菌感染109例，非细菌感染32例，其中非细菌感染组中，单纯肺部真菌感染7例，支气管扩张1例，结节病1例，复发性多软骨炎1例，肺淋巴管肌瘤病1例，哮喘1例，多浆膜腔积液1例，急性肺水肿1例，肺部阴影性质不明18例。

表1 患者基线资料Tab.1 Baseline characteristics of the patients

2 两组 BALF 细胞分类计数比较 细菌感染组中性粒细胞比例为47.0(25.7，86.1)%，非细菌感染组为9.6(3.7，26.1)%，差异有统计学意义(P<0.001)。同时两组巨噬细胞比例、淋巴细胞比例差异有统计学意义，嗜酸性粒细胞比例差异无统计学意义(表2)。

表2 细菌感染组与非细菌感染组BALF细胞分类结果(%)Tab.2 BALF cell classification results of the bacterial infection group and the non-bacterial infection group (%)

3 中性粒细胞比例诊断肺部细菌感染的敏感度与特异性 进一步探讨中性粒细胞比例对肺部细菌感染的诊断效能。以细菌感染组109例为阳性样本，以非细菌感染32例为阴性样本，建立受试者工作特征曲线 (receiver operation characteristic，ROC)诊断分析模型。以软件拟合之ROC曲线读取约登指数最大值点，对应计算理论阈值和各项参数。并按实测样本计算敏感度、特异性、准确度。结果显示： BALF中性粒细胞比例诊断肺部细菌感染的阈值为25%，敏感度为0.844，特异性为0.969，ROC曲线下面积为0.899(表3，图2)。

表3 ROC分析结果Tab.3 ROC analysis results

图2 中性粒细胞比例诊断肺部细菌感染ROC分析Fig.2 ROC analysis of neutrophil ratio in the diagnosis of pulmonary bacterial infection

讨 论

肺炎主要分为社区获得性肺炎与医院获得性肺炎，两者在致病菌谱、潜在耐药菌和多重耐药菌感染风险、抗菌药物选择等方面存在明显差异[9]。社区获得性肺炎的重要致病原为肺炎支原体和肺炎链球菌，而医院获得性肺炎常见的病原菌包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌等[2,10]。目前临床常见的病原微生物检测方法主要包括直接涂片镜检、分离培养、免疫学和核酸检测以及敏感度较高的宏基因组二代测序技术(metagenomics next generation sequencing，mNGS)[11]。而涂片镜检无法判断镜下细菌是感染还是定植或污染，分离培养、mNGS等所需时间较长(至少2 d)，无法第一时间指导危重症患者治疗方案，且常规革兰染色和体液培养的阳性率一般低于60%，导致病情延误，诊断不明确[12-14]。而BALF细胞分类计数2 ~3 h 内即可完成。

本研究分析发现，相比于非肺部细菌感染组，细菌感染组BALF中性粒细胞比例显著上升。通过ROC分析，中性粒细胞比例诊断肺部细菌感染的阈值为25%，ROC曲线下面积为0.899，具有较高的敏感度和特异性。符合国外文献中BALF低中性粒细胞比例是排除呼吸机相关性肺炎的依据这一观点[15]。

中性粒细胞升高对于肺部细菌感染有较强提示意义，但在包括难治性哮喘、慢性支气管炎、特发性肺纤维化、石棉肺、急性呼吸窘迫综合征等一系列疾病中，BALF中性粒细胞比例均可见升高。因此BALF中性粒细胞比例升高并不能作为诊断肺部细菌感染的唯一标准，当BALF中性粒细胞比例高于25%时，提示存在肺部细菌感染的可能性大，同时必须结合患者临床症状、影像学特点、既往病史等进行综合诊断。

本研究排除了近10%的质量差标本，提示临床工作中须规范化肺泡灌洗操作才能获得合格的下呼吸道标本。目前大多数临床实验室在BALF的细胞学检查中只报告细胞比例的差异，将微生物学、分子肿瘤学、细胞学交给微生物学、分子生物学和病理实验室，检查结果相对延迟，无法第一时间指导危重症患者治疗方案。因此，我们强调细胞学检查同时应研究异常成分，如真菌、细菌、肿瘤细胞等，即时的检查结果可提高治疗的充分性与及时性。快速现场微生物学评价(microbiological rapid on-site evaluation，M-ROSE)是对下呼吸道标本制片后通过迪夫快速染色、革兰染色等进行镜下观察和判读[16-18]。目前我科经多年努力建立的床旁病原学M-ROSE体系，能够在半小时内初步判定床旁下呼吸道标本是否合格，并通过细胞学分类和炎性细胞内病原体甄别初步判定是否存在感染以及感染的致病原，在较短时间内完成BALF的细胞学与病原学初步分析[19]。未来，M-ROSE技术可能是改善BALF质量，快速精准诊断指导临床重症肺炎个体化治疗和合理使用抗生素的关键。

综上所述，BALF中性粒细胞比例超过25%对于肺部细菌感染有较强的提示价值，但仍需结合患者临床症状、影像学特点、既往病史等进行综合评价。同时本研究为回顾性研究，仍需多中心前瞻性研究进一步验证。