廖美华，张 涛，赖冬萍，杨 武，丁明健

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530011；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

中医有“无湿不成泄”之说。王叔和有云：“湿多成五泄”；《景岳全书》云：“泄泻之本，无不由于脾胃，泄泻当实脾利水”。脾虚湿盛是泄泻的主要病机。《慎斋遗书》有云：“诸病不愈，必寻到脾胃之中”；《金匮要略》云：“四季脾旺不受邪”。因此，应用中医药治疗泄泻多半从“健脾、利湿”入手。参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》，由四君子汤加山药白扁豆莲肉薏苡仁砂仁桔梗而成，后又加之以陈皮，有益气健脾、渗湿止泻之功，治疗腹泻型肠易激综合征（diarrheal irritable bowel syndrome，IBS-D）疗效确切［1，2］。参苓白术散干预IBS 的机制尚不明确，而既往研究都是单体或碎片式研究，未形成网络，不利于系统化新药研发。本文利用网络药理学、分子对接等手段挖掘参苓白术散干预IBS 的可能机制，为新药研发、中医药的现代化提供思路。

1 数据来源及分析方法

1.1 活性化合物及有效靶点筛选

本研究通过中药系统药理学和分析平台CMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以该网站推荐的生物利用度指标OB≥30% 及类药性指标DL≥0.18 为条件，分别筛选出参苓白术散各组成药物符合条件的化合物（活性化合物），同时从对应药物的Related Targets 栏目中搜集出该方剂涉及的所有靶点，并借助Perl 语言程序筛选出其活性化合物对应的靶点，然后使用uniprot 数据库和Perl 语言程序将活性化合物对应的靶点转换为对应的Gene Symbol 并剔除Gene Symbol 为空白的靶点，剩余靶点即为参苓白术散的有效靶点。

1.2 IBS-D 疾病靶点获取

以“IBS-D”、“D-IBS”、“Diarrhea irritable bowel syndrome”、“Diarrhea irritable bowel syndrome”、“Diarrhea-irritable bowel syndrome”、“irritable bowel syndrome-Diarrhea”、“irritable bowel syndrome-D”和“D-irritable bowel syndrome”为关键词分别在Gene-Cards（https：/ /www. genecards. org /）和OMIM（https：//omim.org/）中查找出与腹泻型肠易激综合征（IBS-D）相关的靶点，汇总并删除重复靶点后得到IBS-D 对应的疾病靶点。

1.3 参苓白术散有效靶点与IBS-D 疾病靶点的交互关系分析

通过R 语言程序对参苓白术散有效靶点与IBS-D 疾病靶点进行Venny 分析，查找两者之间的交集靶点。

1.4 参苓白术散对IBS-D 的调控网络分析

使用Perl 语言程序从参苓白术散有效靶点的Gene Symbol 列表和参苓白术散与IBS-D 的交集靶点列表中整理出参苓白术散-参苓白术散的活性化合物-参苓白术散对IBS-D 的作用靶点及IBS-D 疾病四者之间的关系网络、各个对应节点的属性（疾病、基因、药物或有效成分分子）和有效成分分子列表，然后采用Cytoscape 对获得的数据进行可视化处理，构建参苓白术散-参苓白术散的活性化合物-参苓白术散对IBS-D 的作用靶点及IBS-D 疾病四个要素间的全局性调控网络，并利用CytoNCA插件对该调控网络进行拓扑分析，筛选出网络中最关键的节点。

1.5 参苓白术散对IBS-D 的作用靶点蛋白互作网络（PPI 网络）构建及核心基因筛选

将Venny 分析得到的参苓白术散有效靶点与IBS-D 疾病靶点间的交集靶点导入String 数据库（https：//string-db. org/cgi/input. pl）的“Multiple Proteins”栏目中，物种选择“Homo sapiens”，选取置信度高于0.7 的数据，去掉游离点后导出蛋白互作网络图及对应的互作关系列表，然后使用R 语言程序对互作关系列表中各蛋白的连接节点数进行计数，筛选出连接节点数最多的蛋白基因作为核心基因并作柱状图进行可视化。

1.6 关键活性化合物与核心靶蛋白的分子对接模拟分析

取参苓白术散对IBS-D 的调控网络关键靶点及PPI 网络关键靶点的交集作为参苓白术散对IBS-D 作用潜在的最佳靶点，在RCSB PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）中导出各蛋白评分最高的PBD 格式分子结构文件，物种选择“Homo sapiens”；在CMSP 数据库中（http：//tcmspw.com/ tcmsp.php）导出参苓白术散对IBS-D 调控网络中筛选出的关键化合物的mol2 格式分子结构文件并在ZINC数据库（http：//zinc.docking.org/）中导出IBS-D 治疗常用西药匹维溴铵的mol2 格式分子结构文件。采用Ledock 软件（http：//www.lephar.com/）对上述核心靶点进行预处理后再与上述关键化合物进行分子对接模拟，得到分子对接的最小结合能。

1.7 参苓白术散对IBS-D 的作用靶点（gene ontology，GO）功能富集注释分析

将参苓白术散有效靶点与IBS-D 疾病靶点间的交集靶点导入DAVID6.8 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），物种选择“Homo sapiens”，对交集靶点进行GO 功能富集分析，包括生物过程（BP，biological process），细胞组分（CC，cellular component），分子功能（MF，molecular function）三个方面的富集分析。

1.8 参苓白术散对IBS-D 的作用靶点（ kyoto encyclo-pedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

使用R 语言程序和Bioconductor 数据库（https：//www.bioconductor.org/）中的“clusterProfiler”包对Venny 分析得到的交集靶点以物种“hsa”，P-value =0.05，Q-value =0.05 进行KEGG 富集分析。根据KEGG 富集结果使用R 语言程序作相应的气泡图并在Bioconductor 数据库的“pathview”包中下载得到对应的通路图。

2 结果

2.1 活性化合物及有效靶点筛选

通过TCMSP 软件以OB≥30% 和DL≥0.18为条件筛选出参苓白术散的活性化合物共184 个，其中人参22 个，茯苓15 个，白术7 个，白扁豆1 个，陈皮5 个，山药15 个（已去掉1 个重复化合物），甘草89 个（已去掉3 个重复化合物），莲子10 个（已去掉1个重复化合物），砂仁8 个（已去掉2 个重复化合物），薏苡仁6 个（已去掉3 个重复化合物），桔梗6 个（已去掉1 个重复化合物）。各药物对应的部分活性化合物信息见表1。

表1 参苓白术散部分活性化合物基本信息Tab 1 Basic information of some active compounds in Shenlingbaizhu powder

从参苓白术散各组成药物的Related Targets 栏目中搜集出该方剂涉及的不重复靶点共926 个，其中上述184 个活性化合物对应的靶点为293 个，转换后得到有Gene Symbol 的有效靶点为244 个。

2.2 IBS-D 疾病靶点获取

删除重复项后，从GeneCards 和OMIM 中共搜集到IBS-D 相关靶点共2 724 个。

2.3 参苓白术散有效成分与IBS-D 靶点的Venny分析

Venny 分析结果显示，参苓白术散的244 个有效靶点中有175 个同时为IBS-D 相关的疾病靶点，如图1 所示。交集靶点名称详见表2。

表2 参苓白术散的活性化合物与IBS 的交集靶点Tab 2 Intersection targets of active compounds of Shenlingbaizhu powder and IBS

图1 参苓白术散活性成分与IBS-D 靶点Venny 分析图Fig 1 The active ingredients of Shenlingbaizhu powder and the Venny analysis diagram of IBS-D target

2.4 参苓白术散对IBS-D 的调控网络分析

采用Cytoscape 软件将参苓白术散-参苓白术散的184 个活性-参苓白术散对IBS-D 的175 个作用靶点及IBS-D 疾病4 个要素构成的调控网络进行可视化，如图2。

图2 参苓白术散及其活性成分与IBS-D 及参苓白术散对其有效作用靶点的调控网络Fig 2 The regulatory network of Shenlingbaizhu powder and its active components，IBS-D and Shenlingbaizhu powder on its effective target

表3 中的拓扑分析结果显示连接节点数前50位中包含了quercetin、luteolin、kaempferol 等25 个关键化合物和PTGS2、ESR1、AR 等23 个关键靶点。

表3 调控网络拓扑分析结果Tab 3 Topology analysis results of regulatory network

2.5 参苓白术散对IBS-D 的作用靶点蛋白互作网络（PPI 网络）构建及核心基因筛选

图3 为参苓白术散对IBS-D 的作用靶点的PPI网络图，统计各靶点的连接节点数，取排名前30 的节点作为蛋白互作网络中的核心基因，包括AKT1、IL6 及JUN 等基因，如图4 所示。

图3 交集靶点的PPI 网络图Fig 3 PPI network diagram of the intersection targets

2.6 分子对接

取调控网络中点度中心性排序前50 的节点中的靶点和参苓白术散活性成分与IBS-D 交集靶点PPI 网络连接节点数前30 位的靶点之间的4 个交集靶点PTGS2、ESR1、AR、MAPK14（PDB ID 分别为5KIR、5ACC、2Q7K、5ETC）作为干预网络中潜在的最佳靶点，分别与调控网络中点度中心性排序前50 的节点中包含的全部25 个参苓白术散的核心化合物及参照物匹维溴铵进行分子对接。

由表4 结果可知，参苓白术散25 个关键化合物中与PTGS2、ESR1、AR、MAPK14 这4 个潜在最佳靶点的分子对接结合能低于匹维溴铵与同一靶蛋白结合能的数量分别有12 个、20 个、23 个和5 个，与4 个靶蛋白对接结合能均低于匹维溴铵的潜在最核心合物有4 个，分别是quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山奈酚）和isorhamnetin（异鼠李素）。说明参苓白术散中有较多组分与IBS-D相关蛋白网络具有很好的结合作用，即参苓白术散对IBS-D 可进行多靶点干预。

表4 分子对接结果Tab 4 Results of molecular docking

2.7 参苓白术散对IBS-D 的作用靶点GO 功能富集注释分析

参苓白术散对IBS-D 的作用靶点的GO 富集分析网络共涉及246 个生物过程（BP），其中92 个过程P＜0.01，取P最小的20 个BP 过程作图，如图5，显示参苓白术散干预IBS-D 过程最可能与RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、不含配体的外源性凋亡信号通路、细胞因子应答、DNA 转录和免疫应答等过程相关。

图5 GO-BP 分析结果Fig 5 GO-BP analysis results

GO 富集分析网络涉及的细胞组分（CC）共33种，其中P＜0.01 的有18 种，如图6 所示，结果显示参苓白术散干预IBS-D 过程最可能与细胞外空隙、细胞质液、细胞核、细胞外基质和原生质膜的组成部分等细胞组分相关。

图6 GO-CC 分析结果Fig 6 GO-CC analysis results

GO 富集分析网络涉及的分子功能（MF）总共有54 个，其中P＜0.01 的有21 个，如图7 所示，显示参苓白术散干预IBS-D 过程最可能与蛋白质同源二聚活性、蛋白质异源二聚活性、药物结合、MAP 激酶活性、血红素结合及肾上腺素结合等分子功能相关。

图7 GO-MF 分析结果Fig 7 GO-MF analysis results

2.8 参苓白术散对IBS-D 的作用靶点KEGG 通路富集分析

参苓白术散对IBS-D 的作用靶点KEGG 通路富集共涉及172 条，取基因占比前20 的通路作气泡图，如图8 所示。

图8 KEGG 通路富集分析结果Fig 8 KEGG pathway enrichment analysis results

KEGG 通路富集分析结果显示，参苓白术散对IBS-D 的干预最有可能与卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙肝通路、人巨细胞病毒感染、血流剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症的AGE-RAGE 信号通路、丙肝通路、前列腺癌、TNF 信号通路等相关。典型通路图见图9。

图9 TNF 信号通路图Fig 9 TNF signaling pathway diagram

3 讨论

参苓白术散是治疗脾虚湿盛型IBS-D 的主方，由人参、茯苓、白术、白扁豆、陈皮、山药、甘草、莲子、砂仁、薏苡仁和桔梗共11 味药组成，活性化合物数量达到184 个，可作用于IBS-D 的靶点达到175个，因此对IBS-D 干预机制的排列组合极其丰富。

参苓白术散对IBS-D 的调控网络中，槲皮素以221 个连接节点数在核心化合物中占据首位，木犀草素、山奈酚、豆甾醇和柚皮素等紧随其后，成为有效化合物的热门选项。而调控网络中的靶点则以前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、雌激素受体1（ESR1）、雄激素受体（AR）、过氧化物酶体增生激活受体（PPARG）和前列腺素内过氧化物合酶1（PTGS1）的连接节点数最多，即具有最大概率参与参苓白术散对IBS-D 的干预过程。在参苓白术散对IBS-D 的作用靶点蛋白互作网络中，蛋白激酶（AKT1）、白细胞介素-6（IL6）、JUN 蛋白、丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）和信号传导与活化转录因子3（STAT3）等蛋白具有最多的连接节点数，即在参苓白术散对IBS-D 的调控信号通路中最有可能居于核心地位，是潜在的最理想药物干预靶点选项。在前30 位的核心蛋白中，PTGS2、ESR1、AR、MAPK14 在参苓白术散对IBS-D 的调控网络中亦居于主导地位，即既可多路径向上接收药物有效成分的调控信号，亦可将接收的调控信号向下传导作用于IBS-D。因此，PTGS2、ESR1、AR、MAPK14四个靶蛋白是参苓白术散干预IBS-D 潜在的最佳靶点选项。从分子对接结果分析，发现参苓白术散25 个关键化合物中的槲皮素、木犀草素、山奈酚和异鼠李素与PTGS2、ESR1、AR、MAPK14 这4 个靶蛋白的对接结合能均低于匹维溴铵与相应靶蛋白的对接结合能，即槲皮素、木犀草素、山奈酚和异鼠李素4 个化合物与4 个潜在最佳靶点的结合能力优于匹维溴铵。由此可知，参苓白术散对IBS-D 的干预效果无论从靶点的数量上还是与靶点的结合容易程度上评估均优于匹维溴铵。槲皮素、木犀草素、山奈酚和异鼠李素均是常见的生物类黄酮，具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用［3-9］。前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2），又称环氧合酶2（COX-2），是一种诱导酶，在疼痛和炎症机制等方面发挥着重要作用，制药界高度关注的靶点分子之一［10，11］；雌激素受体1（ESR1）为类固醇激素核受体，是雌激素功能的重要中介，在人体内介导各种疾病，调节生殖、心血管、骨骼、内分泌、神经和免疫系统的生理和病理过程，与多种内分泌相关疾病及多种癌症等疾病相关［12，13］；雄激素受体（AR）也是一种类固醇激素受体，在人体组织中表达广泛，与雌激素受体1 一样，与多种内分泌相关疾病及多种癌症等疾病相关［14-16］；丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）是一种能被不同的细胞外刺激激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，其能调节炎症介质的产生，并控制细胞的增殖、分化、迁移和存活，其在内皮细胞中的激活导致肌动蛋白重塑、血管生成、DNA 损伤反应，从而对心血管稳态和癌症进展产生重大影响［17-19］。因此，无论是从关键化合物还是潜在最佳靶点方向考虑，参苓白术散干预IBS-D 过程与炎症、癌症及内分泌失调等相关反应和通路密切相关。这与诸多研究中炎症反应参与了IBS-D 的发生的结论一致［20，21］。GO 分析结果表明，参苓白术散干预IBS-D 过程在生物过程方面最可能与RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、不含配体的外源性凋亡信号通路、细胞因子应答、DNA 转录和免疫应答等相关，在细胞组分方面最有可能与细胞外空隙、细胞质液、细胞核、细胞外基质和原生质膜的组成部分等相关，而在分子功能方面则最可能与蛋白质同源二聚活性、蛋白质异源二聚活性、药物结合、MAP 激酶活性、血红素结合及肾上腺素结合等相关。而KEGG 通路富集分析结果显示，参苓白术散对IBS-D 的干预最有可能与卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙肝通路、人巨细胞病毒感染、血流剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症的AGE-RAGE 信号通路、丙肝通路、前列腺癌、TNF 信号通路等相关，与前述分析及文献报道结果相符。

综上所述，参苓白术散对IBS-D 的干预效果无论从靶点的数量上还是与靶点的结合容易程度上评估均优于匹维溴铵，其干预IBS-D 过程可能与炎症、癌症及内分泌失调等相关反应和通路密切相关，其中槲皮素、木犀草素、山奈酚和异鼠李素为干预网络中潜在的最核心化合物，PTGS2、ESR1、AR、MAPK14 这4 个靶蛋白为干预网络中潜在的最佳靶点选项。