耿 越 孙璐颜

(山东师范大学生命科学学院食品营养和安全重点实验室,山东省动物抗性生物学重点实验室，250014，济南)

人类第一次发现多肽物质是在1902年，伦敦医学院的两位生理学家Bayliss和Starling在动物胃肠里发现了胰泌素[1].肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，氨基酸是构成肽的基本基团.我们将含超过50个氨基酸残基的称为蛋白质，低于50个氨基酸残基的称为肽.含2个或3个氨基酸残基的称为小肽，低于10个氨基酸残基的称为寡肽，又称低聚肽.

1 传统的观点

蛋白质消化吸收的研究经历了从游离氨基酸到小肽再到寡肽.1901年，传统的蛋白质消化吸收学说表明蛋白质必须被完全水解为游离氨基酸(FAA)才能被小肠吸收[2].1973年，Adibi和Mercer征集男性志愿者服用含有牛血清白蛋白的测试餐，研究发现肠腔内容物与外周血浆中小肽形式存在的氨基酸比以自由形式存在的氨基酸要多[3].随后Newey[4]、Matthews、Gardner[6]等人先后均证明了小肽可以被直接吸收.1977年，Adibi和Morse[7]研究了四甘氨酸的吸收，结果显示肠道吸收的甘氨酸是从四甘氨酸或更高的肽中水解而来的，得出四甘氨酸不能被已知肽载体体系完整转运吸收的结论.

目前国内营养学教材中关于寡肽吸收的表述基本一致，多数认为：①蛋白质水解产物1/3为氨基酸，2/3为寡肽;②小肠黏膜细胞存在吸收二肽、三肽转运体系，胞浆内氨基肽酶分解二肽、三肽为氨基酸;③氨基酸吸收是耗能需钠需载体的主动转运过程;④全蛋白吸收：新生儿通过胞饮获得母体抗体；成年不存在这种吸收，误食异源蛋白会过敏反应[8].并且基本认同：①一般认为四肽以上并不直接吸收进入肠黏膜细胞;②含脯氨酸或羟脯氨酸的二肽少部分直接进入血液[9, 10].比较新的观点认为小肽的转运系统是非依赖钠型的系统[11].2019年《营养学导论》[12]提出小肽吸收转运系统可能有以下三种：依赖氢离子或钙离子浓度的耗能主动转运、pH依赖性的非耗能性钠离子/氢离子交换转运、谷胱甘肽转运系统.

随着对多肽吸收机制的深入研究，目前教科书的观点已显陈旧和落后，有关寡肽吸收的内容急需总结和更新.

2 近年的研究

研究肽类肠道吸收的实验分为体内和体外.体内实验多用大鼠进行动物实验，体外多用Caco-2细胞模型.肽在小肠或Caco-2膜上的跨膜迁移率可以通过速度系数Papp来评估[13].但由于Caco-2细胞来源于结肠，缺乏小肠上皮中的粘液层及肠道菌群代谢酶，因此该模型不能完全模拟药物在小肠中的吸收过程[14].为了更好地评价肽的吸收，区分目标肽和内源性肽，稳定同位素标记肽与单同位素质谱结合检测被认为是一种更可靠的方法[13].

2.1初乳中免疫球蛋白G初乳是指产后2～3 d内所分泌的乳汁的统称，初乳中的蛋白质含量远远高出常乳.新生儿防止感染和增强免疫主要靠初乳中丰富的免疫球蛋白(80%IgG)、乳铁蛋白、生长因子、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞.研究证明新生儿时期肠道具有高渗透性，IgG的吸收是由肠上皮细胞的胞饮作用介导[15].

然而初乳产量低、初乳中IgG浓度低、母体的身体损伤等情况使得新生儿免疫不足.Boland等人[16]研究发现高矿物质饮食会降低羔羊的血清IgG浓度，导致新生儿吸收IgG的能力受损.而Kamada等人[17]研究表明在初乳中添加硒可提高犊牛血清中IgG含量.Campbell等人[18]证明了初乳补充剂可以给新生仔猪提供可吸收IgG.

2.2乳源ACE抑制肽血管紧张素Ⅰ转化酶(AngiotensinⅠ-Converting Enzyme，ACE)是一种羧二肽酶，能使血管平滑肌收缩、血压升高.ACE抑制肽是经过蛋白质分解酶的作用产生的一类具有能抑制ACE活性的多肽物质，它通过抑制ACE的活性而起到降低血压的作用.

乳源ACE抑制肽能否被肽酶水解，与其肽链长度和氨基酸组成有关.对于四肽或以上的肽在刷状缘膜超过90%被水解，三肽10%～60%，而二肽是10%[19].

Satake等人[20]利用Caco-2模型证明最早被发现的乳源ACE抑制肽VPP，是通过细胞旁路转运吸收的.2002年，Vermeirssen等人[21]利用MALDI-TOF质谱发现七肽Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg在投药后10 min内完整转运入细胞内.

薛海燕等人[22]通过体外模拟消化和FITC荧光标记研究了牛乳酪蛋白的ACE抑制肽的活性及其肠道吸收.结果表明FITC-酪蛋白经过胃肠消化后荧光标记稳定存在，存在ACE抑制肽且水解物的分子量在5 kDa以下，并可被大鼠肠道吸收.此前张倩等人[23]也通过FITC标记证明了FITC-鹿茸蛋白水解物在45 kDa以下可被肠道吸收.Ozorio等人[24]利用尤斯室(Ussing Chamber)灌流系统模拟人的肠道，研究UC装置的基底外侧室和仔猪近端空肠段，得到β-乳球蛋白和β-酪蛋白的水解肽分子量在656～4 086 Da之间，包括寡肽、多肽，说明寡肽可被小肠完整吸收.

2.3胶原蛋白肽(CPs)Yoshihiro等人[25]采用大鼠小肠和肝脏原位灌注的方法，研究口服胶原蛋白水解物(CH)的吸收，发现较大的肽如十五肽(GEAGPAGPAGPAGPR)，在体内可以被吸收，原因可能是许多含羟脯氨酸的肽(HCPs)对血清肽酶高度耐药.

Chinfang Liu等人[26]利用原位血管灌注技术研究了十五肽(Pro-Hyp-Gly)5在大鼠小肠中的吸收.经鉴定(Pro-Hyp-Gly)5的消化吸收形态为Gly-(Pro-Hyp-Gly)4、(Pro-Hyp-Gly)4、Gly-(Pro-Hyp-Gly)3、Gly-(Pro-Hyp-Gly)2和(Pro-Hyp-Gly)2，原因可能是Hyp-多肽对细胞内水解具有抗性.

2.4其 他1998年，Yoshimichi等人[27]研究证明合成肽001-C8-NBD(H-MeTyr-Arg-MeArg-D-Leu-NH(CH2)8NH-NBD)可以被体内肠道完整吸收.

3 多肽的吸收通路

目前肽的转运途径包括载体介导的主动转运、紧密连接的细胞旁路转运、细胞胞吞转运和被动跨细胞转运途径(图1).每一种机制都可以单独发生或与其他机制联合发生，而同一肽可能利用一种或多种不同的方法.

图1 小肠跨膜渗透途径[28]

3.1寡肽转运载体(PeptideTransporter1，PepT1)低亲和力、高转运能力的转运蛋白，可广泛识别具有寡肽及类似结构的分子[29].寡肽转运以H+浓度梯度为原动力[29]，PepT1的功能严格依赖于跨膜质子梯度和内负膜电位[30].在H+电化学梯度的协助下，PepT1介导的转运主要参与二肽和三肽的转运，且这些肽一般为中性电荷的非极性疏水肽.

Seong-Min Hong等人[31]研究证明设计的三肽Gly-Gly-Sar、Gly-Sar-Sar和二肽Gly-Sar通过PepT1运输穿过Caco-2细胞，而四肽Gly-Sar-Sar-Sar和五肽Gly-Sar-Sar-Sar-Sar通过细胞旁紧密连接途径运输.

梁丽娟等人[32]研究了环肽Astin C在Caco-2细胞单层模型中的吸收机制.Astin C是氯代环五肽类化合物代表(图2)，具有一定的抗肿瘤活性和免疫抑制活性.研究表明，Astin C是一种吸收中等的药物，可能被小肠顶端(Apical Side，AP)侧膜的转运蛋白所转运，并且推断其吸收率在20%～70%之间.

图2 环肽Astin C结构图[32]

3.2细胞旁路转运首选中性或带负电荷、小分子和亲水性多肽亲水肽更倾向于通过细胞旁扩散通过肠上皮细胞[33].对于细胞旁转运，已经有两种不同的方法通过调节紧密连接的通透性来增加肽吸收[34].

早在1994年，Pappenheimer等人[35]就利用大鼠模型，通过放射性标记法证明了EASASYSA这种寡肽复配5%葡萄糖可以通过细胞旁路方式转运.1996年，Tamura等人[36]通过 Caco-2模型证明Val-Val-Val可通过细胞旁路转运.1997年，Shimizu等人[37]证明了GGAR通过旁路转运.

2008年，刘冬等人[38]研究了重组型降血压肽Val-Leu-Pro-Val-Pro(VLPVP)在Caco-2细胞模型中的吸收机制，通过添加旁路转运促进剂去氧胆酸钠确定VLPVP主要是通过细胞旁路转运穿过小肠上皮细胞的.

除上述提到的肽，另外WDHHAPQLR(RAP)，一种来自油菜籽蛋白的抗氧化肽[39]，在水解后，水解产物DHHAPQLR和WDHHAP也通过细胞旁路运输，而QLR由PepT1运输.

3.3被动扩散是药物和许多营养物质从胃肠道吸收到血浆的最常见方式[40]被动式跨细胞扩散包括被动式摄取(优选疏水)多肽进入细胞、细胞内运输和基底外侧分泌[41].寡肽通过被动扩散的转运取决于肽的大小、电荷和疏水性等特性.

3.4内吞是一种能量依赖的跨细胞运输，有利于长链和高疏水性肽的运输[41]1997年，Shimizu等人[37]证明缓激肽Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg通过胞吞转运.

植物环肽Kalata B1，具有由6个固定半胱氨酸组成的三对二硫键形成稳定的六环结构，即CCK结构(图3).CCK结构的存在，赋予环肽较直链肽更强的耐热、耐化学降解及耐酶解的能力.Henriques等人[43]研究Kalata B1具有细胞穿透特性，可以通过内吞、膜易位的方式进入细胞.

图3 环肽CCK结构[42]

由于M细胞(Membranous cell,M cell)的高内吞能力和DCs(Dendritic cells)抗原呈递特性，这类细胞可被开发为一种潜在的蛋白和多肽传递途径[44].早些年有人提出，人体在小肠中产生和吸收内源性纳米颗粒，M细胞的胞吞作用似乎绕过了溶酶体,经M细胞向抗原呈递细胞的胞吞作用后，内源性纳米颗粒被分解.这一机制对肽传递到局部免疫系统很有意义，例如口服疫苗.

4 寡肽口服给药研究

4.1吸收障碍研究证实某些多肽可以直接被肠道吸收，但是食物蛋白质消化后大部分以氨基酸和小肽形式吸收，少部分以多肽吸收[45]，原因是蛋白质经口服后，胃肠道上皮对肽类食物和药物的吸收起着物理和生化屏障的作用(图4).

图4 口服肽给药的胃肠道屏障[46]

蛋白质的品质、采食水平、肽链长度、氨基酸残基的构型与载体及动物健康状态也是影响吸收的因素.Savoie等人[47]对19种动、植物性(豆科、谷物)蛋白质进行体外消化试验，发现动物性蛋白质释出的肽与游离氨基酸的比例最高，谷物蛋白质的释放量最低.Hanh等人[48]研究证实了衰老和高血压的发展会影响肽的吸收.

4.2应 用2019年9月20日，全球首个口服胰高血糖素样肽-1受体激动剂(Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Agonist，GLP-1 RA)索马鲁肽片由美国FDA 批准上市.索马鲁肽刺激胰腺β细胞分泌胰岛素并抑制胰腺α细胞分泌胰高血糖素从而降低空腹和餐后血糖.如图5所示，索马鲁肽由31个氨基酸组成，结构类似于天然胰高血糖素样肽-1(GLP-1).第8位的丙氨酸被α-氨基异丁酸取代，这使药物对二肽基肽酶4(DPP-4)的降解更具抵抗力; 在26位的赖氨酸上增加了十八碳链烷基二酸，增加了与白蛋白的结合力，延长了血浆半衰期并降低了药物的肾脏清除率; 34 位赖氨酸被精氨酸取代，可以通过限制分子中剩余赖氨酸的酰化来增强药物的稳定性，促进了药物在胃黏膜的吸收[49].

图5 索马鲁肽片剂结构

Garcia-Castillo等人[50]合成了一种经过神经酰胺和寡糖结构域修饰的糖鞘脂，肠促胰岛素激素(GLP-1)与其共价结合，使脂质作为分子载体，可以在粘膜上被吸收，转运效率提高20～100倍.

细胞穿透肽(Cell-Penetrating Peptides，CPPs)，通过非共价分子间的相互作用，在口服胰岛素给药系统中作为一种潜在的吸收增强剂.Khafagy等人[51]研究一种新型渗透蛋白(Penetratin)—“PenetraMax”的肠道促吸收能力，得出L型和D型的PenetraMax分别在回肠和结肠增加肠道胰岛素吸收的能力最大.阳离子精氨酸和疏水色氨酸是CPPs细胞内化的关键氨基酸成分.Kamei等人[52]研究发现L-精氨酸和L-色氨酸可以增强胰岛素口服给药.

表1 可以穿透细胞的肽的氨基酸序列和分子量

CPPs对胃肠道的递送效果是非特异性的，为了实现肽介导的靶向递送，应用噬菌体展示技术，可以从多种多样的肽库中筛选出具有特定功能的新型选择性肽[44].

几十年来，科学家们研究了多种技术以提高多肽药物的口服生物利用度，包括使用酶抑制剂(如糖胆酸钠、胰蛋白酶抑制剂、甲磺酸卡莫司他、杆菌肽、卵泡素)和渗透促进剂(Penetration Enhancer，PE)(如洗涤剂、表面活性剂、胆盐、螯合剂)、化学修饰、粘着聚合物(PEGs, P(MAA-g-EG)，凝集素微粒，硫代聚合物)、纳米载体、油相基质及结肠靶向等[40,53,54].PepT1靶向的聚合物胶束极大地增强了水溶性差的药物的口服吸收[55].多孔硅胶是一种新型有效的肽类微载体.Imai等人[56]研究表明多孔硅胶具有保护肽降解的潜力.

5 其他吸收通道

除肠道吸收途径，多肽类药物其他吸收途径的研究及临床应用也取得了进展.以胰岛素为例，目前已经研究出了一系列的无针给药方法作为每日胰岛素治疗的替代方法，包括口服、肺、鼻和经皮方法[57].

5.1透皮吸收近年来，胰岛素经皮给药作为皮下治疗糖尿病的一种有吸引力的替代方法被广泛研究.透皮系统输送的胰岛素能够避免消化道中的化学和酶降解[57].Yuanpeng Wang等人[58]研究出一种透皮贴片，其被胰岛素/聚L-谷氨酸(PGA)层层包裹实现胰岛素的透皮运输.Yongping Chen等人[59]研究发现合成肽ACSSSPSKHCG可促进胰岛素透皮给药.

5.2粘膜给药鼻粘膜、口腔粘膜给药是肽类药物较适合的给药途径.

2009年，Khafagy等人[60]研究了CPPs是否影响胰岛素的鼻吸收.在给药胰岛素溶液后没有观察到明显的低血糖反应，表明胰岛素在鼻腔中没有吸收发生.相比之下，联合使用0.5 mmol/L胰岛素和CPPs可以增加胰岛素吸收.与其他CPPs相比，L-Penetratin是最有效的胰岛素吸收促进剂.相反，增加D-Penetratin浓度会降低鼻胰岛素吸收效率.但是对于口服胰岛素来说，D-Penetratin是一种强大但短暂的吸收促进剂.另外，给药L-Penetratin并没有改变鼻膜的完整性.

鼻饲胰岛素除治疗糖尿病外，还被认为是阿尔茨海默病(AD)或轻度认知障碍(MCI)的可能治疗方法.Avgerino等人[61]研究胰岛素对AD或MCI患者认知功能的影响，得出鼻内胰岛素改善了apoe4(-)AD或MCI患者的故事回忆能力.Opstal等人[62]利用定制的鼻腔喷雾器使用胰岛素或安慰剂，研究摄入葡萄糖后下丘脑功能性磁共振成像(fMRI)，发现血氧依赖水平(Blood Oxygen Level Dependent，BOLD)的反应下降在鼻内应用胰岛素后增强.

口腔黏膜给药方面提供了许多优势，使其在递送肽和蛋白质方面具有吸引力[63].而且，在发生不良反应时，可以方便快捷地取出制剂.然而，口腔粘膜仍然表现出一些渗透性限制的特性.

5.3其他途径肺部给药系统(Pulmonary Drug Delivery System, PDDS)是指药物经特殊给药装置直接进入呼吸道发挥局部或全身治疗作用的给药系统.PDDS剂型包括定量吸入气雾剂、雾化剂和干粉吸入剂等,近年来多用于哮喘、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病等的治疗.1995年，Stanley等人[64]探究了雾化重组人DNaseⅠ治疗肺部囊性纤维化.

因为肺部药物吸收高而快速，并且避免了首次通过肝脏代谢.所以从肺部吸收多肽和蛋白质比从其他任何非侵入性的给药途径都更有效.然而，长期给健康的肺部用药可能会引起毒性问题，因此明智的做法是考虑用它来治疗短期疾病.吸入胰岛素粉雾剂Afrezza(MannKind公司)在2014年由FDA批准上市.Greene等人[65]研究表明在非临床安全性研究中，长期使用Afrezza没有不良肺部反应.

6 总结与展望

尽管对于寡肽的肠道吸收已经有许多证据表明四肽以上的肽可以被完整吸收，但是这依然是个别肽的例子而并非规律.此外，关于寡肽吸收的实验体外模型与大鼠模型虽然可以与人肠道类似，但是并不是真实的人体肠道环境，真实环境复杂要素要更多.关于寡肽肠道多种通路的深入研究有助于提高寡肽的生物利用度，保证寡肽结构和功能的完整性.进而探究寡肽类药物无痛无损伤的给药途径，增强疗效，减少治疗的痛苦和繁琐，同时也有助于多肽类保健功能因子的开发，有助于多肽类功能食品的机制研究.